【摘要】目的 观察外阴鳞癌(VSCC)组织中HPV感染情况及脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的杂合性缺失(LOH)、微卫星不稳定性(MSI),并探讨其意义。方法 选取VSCC组织24例、外阴尖锐湿疣(VCA)42例、正常外阴组织20例,用PCR法检测上述组织中的HPV6、11、16、18、31、33亚型,用PCR一单链构像多态性分析(PCR-SSCP)法检测FHIT基因D3S1300位点的LOH和MSI。结果 在正常外阴、VCA、VSCC组织中低危型HPV(HPV6/11)阳性分别为2、38、21例,高危型HPV(HPV16/18/31/33)阳性分别为0、13、10例;VCA、VSCC组织与正常外阴组织比较,P均<0.05。在正常外阴、VCA、VSCC组织中,FHIT基因D3S1300位点上LOH、MSI阳性分别为0、9、13例,VSCC与VCA、正常外阴组织比较,P均<0.05。VSCC组织中HR-HPV感染与FHIT基因D3S1300位点LOH/MSI相关(r=0.438,P<0.05)。结论 VSCC组织中存在较高的低危型、高危型HPV复合感染及FHIT基因LOH和(或)MSI;二者在VSCC的发生发展中发挥重要作用。
【关键词】人乳头瘤病毒;脆性组氨酸三联体基因;杂合性缺失;微卫星不稳定性;外阴鳞癌;外阴尖锐湿疣
脆性组氨酸三联体(FHIT)基因是一种候选抑癌基因,恶性肿瘤及其癌前病变组织中常存在FHIT基因异常,如杂合性缺失(LOH)、微卫星不稳定性(MSI)等,与人乳头瘤病毒(HPV)感染可能有关。高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)与宫颈癌和宫颈上皮内瘤变有关,包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、
1 材料与方法
1.1 材料 选取2004~2008年经病理确诊的24例VSCC及42例外阴尖锐湿疣(VCA)患者的病变组织蜡块,以外阴良性病变切除的正常外阴组织20例作为对照;试剂为dNTP、Taq酶;FHIT基因D3S1300位点引物核苷酸序列:F为5′-AGCTCA-CATTCTAGTCAGCCT-3′,R为5′-GCCAATrCCCCA-GATG-3′,产物片段长度为217~241 bp。HPV6、11、16、18、31、33亚型引物核苷酸序列,见表1,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2 HPV感染与FHIT基因LOH、MSI检测方法 用PCR法检测HPV6、11、16、18、31、33亚型,用PCR-单链构像多态性分析(PCR-SSCP)法检测FHIT基因D3S1300位点的LOH和MSI。采用标准酚-氯仿-异戊醇法抽提组织DNA,TE溶解后
1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。组间比较用χ2检验或Fisher精确概率法,相关性分析用Spearman等级相关分析法。P40.05为差异有统计学意义。
2 结果
在正常外阴、VCA、VSCC组织中HR-HPV(HPV6/11)阳性分别为2、38、21例,HR-HPV(HPV16/18/31/33)阳性分别为为0、13、10例;VCA、VSCC组织与正常外阴组织比较,P均<0.05。HPV的PCR产物扩增电泳图,见图1。
在正常外阴、VCA、VSCC组织中,FHIT基因D3S1300位点上LOH、MSI阳性分别0、9、13例;VSCC与VCA、正常外阴组织比较,P均<0.05。FHIT基因D3S1300位点PCR产物扩增见图2,PCR-SSCP电泳图见图3。
相关分析显示,VSCC组织中HR-HPV感染与FHIT基因D3S1300位点LOH/MSI相关(r=0.438,P<0.05),LR-HPV与FHIT基因LOH/MSI不相关(r=0.158,P<0.05)。VCA组织中LR-HPV及HR-HPV感染与FHIT基因LOH/MSI均不相关(r分别为0.169、0.027,P均<0.05)。
3 讨论
自从1996年发现FHIT基因以来,大量研究发现FHIT基因在头颈部恶性肿瘤、肺癌、消化道恶性肿瘤、乳腺癌及宫颈癌等各类恶性肿瘤中存在广泛异常,提示FHIT基因与恶性肿瘤的发生发展有关。恶性肿瘤及其癌前病变组织中FHIT基因的异常与HPV感染可能有关。
林云等研究发现,在VSCC中HPV16/18的感染率比正常对照组高,提示HPV感染可能在VSCC发生发展中起一定作用。本研究结果显示,VSCC和VCA中均存在LR-HPV和HR-HPV的复合感染,且二者比较并无统计学差异。目前,尚无证据表明HR-HPV感染与VSCC的发生相关。
本研究结果显示,VSCC组织中FHIT基因D3S1300位点LOH、MSI阳性率为54.2%,表明FHIT基因广泛出现异常,与其他报道一致;VCA组织中也已出现FHIT的异常(阳性率为21.4%),但较VSCC低(P<0.05)。这提示FHIT基因异常与VSCC发生可能相关,VCA可能是VSCC的前期病变,FHIT基因异常可能是VSCC癌前病变的分子标志。D3S1300位点位于FHIT基因第1编码外显子(E5)附近,该位点出现高频率的LOH和(或)MSI与FHIT基因异常转录本中E5的缺失相吻合,提示FHIT基因缺失在VSCC中较常见。
3p14.2、3p21被认为是LOH集中发生的亚区域,而FHIT基因定位于3p14.2。有研究者认为,HPV病毒可直接整合到FHIT基因脆性位点,引起染色体基因组的不稳定,这可能是HR-HPV致癌的机制之一。Buher等研究发现,FHIT基因LOH与HPV16、31感染有显著相关性;而有研究发现,FHIT基因突变与HPV感染无关,二者是参与宫颈癌发生的两个独立致病因素。本研究结果表明,在VSCC组织中FHIT基因LOH/MSI与HR-HPV感染有关,提示其感染可能是FHIT基因LOH和(或)MSI发生的因素。另外,本研究结果仅反映出FHIT基因片段的LOH和(或)MSI与VSCC的发生有关,不能证实其改变是癌前病变或早期诊断的分子标志物,还是参与VSCC进展的晚期事件,或作为判定患者预后的指标。因此,还有必要扩大样本量,进一步明确FHIT基因的异常在VSCC中的生物学作用以及与其他因素的关系。
(范余娟,蒙亚晴,外阴鳞癌组织中HPV检测及FHIT基因杂合性缺失、微卫星不稳定性观察[J]山东医药2012年第52卷第2期:21-23)