越来越多的基础和临床研究发现氧化苦参碱有抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)作用,但其确切机制尚不明了[1-3]。HBV感染宿主有限,且体外培养困难,限制了HBV及其相关疾病的研究。自1985年以来,各种类型的HBV转基因鼠相继问世,从而为研究HBV及其相关疾病的发病机理和治疗方法开辟了新途径[4-5]。本文应用竞争PCR联合产物酶联杂交技术对HBV转基因鼠血清中HBV DNA进行定量检测,以便评价氧化苦参碱的抗HBV作用,为临床应用提供重要的实验依据。
材 料 和 方 法
1.1 HBV转基因鼠模型的建立[6]
1.1.1 质粒 p1.0HBV由中国科学院生物化学研究所吴祥甫教授惠赠,3.2kb的adr型HBV全基因组DNA克隆在pUC18载体BamHI酶切位点上。
1.1.2 试验用小鼠 购自扬州大学实验动物室8周龄以上的性成熟ICR小鼠,饲养环境为清洁级动物房。
1.1.3 HBV转基因鼠的制备 具体方法按文献所述。
1.2 HBV转基因鼠的整合鉴定[6] HBV转基因鼠于4周龄剪尾0.1~0.5cm,以组织消化液[1M KCl,0.5M Tris-HCl pH8.3,0.1m MgCl2,0.45%NP40(v/v),0.45%Tween-20(v/v),10g·L-1蛋白酶K]中,500C消化过夜,然后加等体积的饱和苯酚/氯仿抽提DNA,无水乙醇沉淀DNA,最后溶解在100uL无菌水中,PCR所用引物为I:5''-AGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTT-3''和II:5''-TACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3'',扩增片段位于HBcDNA区域,长度为470bp。PCR反应体系为5uL 10×缓冲液(0.5M KCl,0.1M Tris-HCl pH8.3,0.015M MgCl2,0.01%明胶),35uL无菌水,5uL 2mM dNTP, 引物I、II各2 uL。950C变性10min,加1uL Taq酶(2个单位),加50uL液体石蜡油密封,反应循环如下:930C变性60s,600C退火45s,720C延伸60s,35次循环,最后720C延伸增加10min。取1/10扩增产物进行电泳鉴定。
1.3 HBV转基因鼠的表达鉴定 Amplicor HBV Monitor检测试剂盒购自Roche Diagnostic Systems,Inc.,具体步骤按说明书推荐的方法进行。从HBV转基因整合阳性的鼠取血,用后眼眶静脉丛取血法收集血清,在标准品和标本中加入相同浓度的内对照,平行按上述方法处理血清,抽取HBV DNA后,行PCR。上游引物序列如下:5''-GTTGCCCGTTTGTCCTCTAC-3'',下游引物5''端以生物素标记,序列如下:5''-Biotin-GATGATGTGGTATTGGGGGC-3''。PCR扩增条件为,940C变性5min;940C变性30s,570C退火30s,720C延伸45s,30次循环,最后720C延伸增加5min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实存在目的条带,再行产物杂交鉴定和定量。
1.4 微反应板酶联杂交定量 按Amplicor HBV Monitor检测试剂盒推荐的方法进行。
1.4.1包被 用结合缓冲液(Bb)稀释共用探针(MXH2 ),序列如下:3''-AGCGTCCAGTCGTCGTTACAC-5'',浓度为500nmol·L-1;取两份DNA微量条排反应板(微孔板),加入稀释后的MXH2 ,每孔50uL,封孔后置370 C水浴箱,2hr。
1.4.2 预杂交 弃去孔内包被液,一份微孔板中每孔加1×杂交液稀释的野生片段捕获探针(Pw),序列如下:5''-TCGCAGGTCAGCAGCATGTGACATCAACTACCAGCACG-3'',浓度为500nmol·L-1,50uL;另一份微孔板中每孔加1×杂交液稀释的突变引物(Pm),序列如下:5''-GTTGCCCGTTTGTCCTCTACATCACACAAAGATCTACGTCGAC GCAGGACCATGCAAGACCT-3'',浓度为500nmol·L-1,50uL。置 550 C水浴箱,60min后弃液、拍干,并用550 C的洗液Ⅰ洗涤两次。
1.4.3 杂交 将PCR产物用蒸馏水作10倍稀释, 1000 C解链5min后立即置冰浴;加等体积2倍杂交液后取50uL加入杂交孔内,置反应板于480 C水浴箱,60min;用洗液Ⅰ洗三次,每次480 C,3min,弃液拍干。
1.4.4 信号检测 每孔加50uL 1:1000稀释的链亲合素-碱性磷酸酶复合物;370 C下放置20min,甩干,用洗液II洗四次,每次370 C,3 min;拍干后用底物对-硝基苯基磷酸二钠显色;2h后读取405nm OD值。
1.5 氧化苦参碱对HBV转基因鼠的影响 取8-12周龄HBV转基因鼠26只,雌雄不分随机分为三组,分别予生理盐水(A组,9只)、氧化苦参碱50mg· kg-1(B组,8只)、氧化苦参碱100mg· kg-1(C组,9只),腹腔注射,每日一次,30d后处死小鼠,取血清定量测定HBV DAN量。
1.6 统计学处理 所有资料应用SAS软件进行统计学处理。
2 结 果
2.1 HBV转基因鼠的HBV DNA整合和复制情况 本文所用的396只HBV转基因鼠中,共检测到HBV DNA整合转基因鼠137只,占34.59%(137/396),其中血清中复制HBV DNA的转基因鼠共26只,占6.56%。
2.2 氧化苦参碱治疗前后HBV 转基因鼠中HBV DNA定量检测结果 氧化苦参碱治疗前后HBV 转基因鼠中HBV DNA定量检测结果见附表。
附表:氧化苦参碱治疗前后HBV 转基因鼠中HBV DNA定量检测结果(单位:fg· mL-1)
组别 A组 B组 C组
例数 X±S 例数 X±S 例数 X±S
治疗前 9 10933.33±5591.06 8 12762.5±4891.96 9 10164.44±5842.93
治疗后 9 10864.44±5492.81 8 5898.375±4597.09* 9 2426.33±1563.12**#
注:与治疗前相比,* P<0.05,** P<0.01;与A组和B组治疗后相比,# P<0.01。
从表中可见,A组、B组和C组HBV转基因鼠在治疗前三组HBV DNA量无显著性差异(P>0.05);与治疗前相比,治疗后A组HBV DNA的量无显著变化(P>0.05),而B组HBV DNA量降低(P<0.05),C组HBV DNA量显著降低(P<0.01)。C组治疗后HBV DNA量明显低于A组和B组(P<0.01),而B组治疗后HBV DNA量低于A组,但统计学无显著性差异(P>0.05)。
3 讨 论
HBV转基因鼠的建立为活体研究HBV致肝癌分子机理研究、肝癌的综合病因研究、乙型肝炎治疗新途径的探讨、抗HBV药物筛选开辟了一个新的领域[4,5,7,8]。我们用显微注射法建立的HBV转基因鼠进行实验,结果显示HBV基因组DNA已整合至小鼠基因组,且能有效表达,证明获得了携带HBV全基因组小鼠,本实验396只HBV转基因鼠中,共检测到HBV DNA整合转基因鼠137只,占34.59%(137/396),其中血清中复制HBV DNA的转基因鼠共26只,占6.56%。血清中HBV DNA的存在,说明HBV基因在小鼠体内有复制[4,5]。
乙型病毒性肝炎的抗病毒治疗至今仍是医学界的一个难题,即使是被公认为最有效的α-干扰素和拉米夫定等,仍存在病毒持续阴转率不高、价格昂贵、有一定的不良反应及存在病毒变异等缺陷。所以,寻找新的有效抗病毒药物,仍为当务之急[5]。氧化苦参碱是从苦参及苦豆子中提取的生物碱,国内学者通过氧化苦参碱的基础和临床研究发现氧化苦参碱有抗HBV作用,因此开发和应用我国中草药资源治疗慢性乙型病毒性肝炎,将有十分重要的社会和经济意义[1]。
体外实验表明[1],氧化苦参碱对HBV DNA转染的细胞株2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg有抑制作用,在一定范围内随着药物浓度增加及作用时间延长,抑制率逐渐增高,在同一浓度和同一作用时间下,都表现为对HBsAg的抑制率高于对HBeAg的抑制率。HBV转基因鼠体内研究发现[3],HBV转基因鼠分别用氧化苦参碱100mg· kg-1、200mg· kg-1、300mg· kg-1 每日一次腹腔注射30d后,肝内HBsAg和HBeAg的量与对照组相比均有明显的下降,在各剂量组之间无显著性差异。蔡雄等报道[2]氧化苦参碱治疗了64例慢性乙型肝炎患者并与α-干扰素进行了比较,结果显示HBsAg和 HBV DNA阴转率分别为44.4%和45.3%,而干扰素治疗后HBeAg和 HBV DNA阴转率分别为46.0%和48.0%,与α-干扰素相比较无差异,表明氧化苦参碱治疗慢性乙型病毒性肝炎的疗效比较理想。
HBV DNA的量直接反映了HBV的复制水平[4]。本实验观察了氧化苦参碱(50mg· kg-1和100mg· kg-1)对HBV转基因鼠血清中HBV DNA的影响,发现这两种氧化苦参碱浓度对HBV转基因鼠HBV DNA复制均有抑制作用,结果表明氧化苦参碱对体内HBV DNA复制有抑制作用,这种作用可能是临床治疗HBV感染的基础。至于氧化苦参碱抑制HBV DNA复制的具体机制尚有待进一步研究。