肿瘤坏死因子 (TNF- )是肿瘤坏死因子超家族的重要成员,可通过死亡受体途径促使靶细胞凋亡,近年研究证实,扁平苔藓的发生与细胞凋亡密切相关,我们通过检测死亡受体途径中TNF- 和下游关键分子半胱氨酸冬氨酸蛋白酶8(Caspase-8)和Caspase-3在扁平苔藓皮损中的表达。探讨其在扁平苔藓皮损发病中的作用。
材料与方法
一、 对象
收集我院皮肤科20例扁平苔藓患者皮损,男13例,女7例,年龄41~73岁,平均39.4岁均经临床和病理共同确诊,同时半年内未使用过糖皮质激素和那样抑制剂类药物。健康对照组20例,取自整形科健康人皮肤,男11例,女9例,年龄32~67岁,平均36.8岁。两组性别和差异无统计学意义。所有组织均制成石蜡标本备用。
二、试剂
兔抗人TNF- 多克隆抗体、兔抗人Caspase-8多克隆抗体、兔抗人Caspase-3多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司);即用型二步法检测试剂盒PV-9000(美国GBI公司),二氨基联苯胺(DAB)试剂(美国Sigma公司);TUNEL试剂盒(美国Roche公司)。
三、 方法
1、免疫组化法:石蜡切片脱蜡至水化;3% 溶液消除内源性过氧化物酶活性。分
别滴加TNF- 、Caspase-8和Caspase-3多抗(滴度分别为1:150,、1:250和1:100),TNF- 、Caspase-8采用已知阳性乳腺癌组织作阳性对照;Caspase-3采用正常扁桃体作阳性对照;磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照,再滴加二步法试剂PV-9000。以上各步骤均采用PBS冲洗5min共3次。DAB显色,苏木素复染、脱水封片。
2、凋亡检测法:石蜡切片脱蜡至水化,过0.3% 甲醇。滴加蛋白酶K工作液,37 孵育30min;滴加新鲜配置的TUNEL反应液,37 孵育60min,以只含标记dUNEL反应液作阴性对照;加过氧化物酶转化剂(POD),37 孵育30min。以上各步骤均采用PBS冲洗5min共3次。DAB显色,苏木素复染,脱水封片。
3、结果判断:免疫组化结果以胞质或胞核着棕黄色为阳性细胞,采用MIAS-2000图像分析系统进行定量分析,用积分广密度值(integrated optical density,IOD)代表每张切片的阳性表达强度,每张切片随机测定5个高倍视野(×400),取平均值,用 ±s表示。凋亡检测结果以胞核着棕黄色为凋亡细胞百分比,取平均值为最终凋亡指数(apoptosis index,AI),用 ±s表示。
4、统计学分析:采用SPSS11.5统计软件分析,组间比较采用成组t检验。指标间相关性采用Pearson相关分析,以 =0.05为检验水准。
结果
一、 免疫组化结果
TNF- 、Caspase-8阳性染色定位于胞质,Caspase-3阳性染色定位于胞质或胞核。扁平苔藓组TNF- 、Caspase-8和Caspase-3阳性细胞主要位于表皮基底层和棘层,表达慢性增强,真皮浅层淡性细胞也有少量表达;健康对照组三者仅在部分标本的基底层偌阳性表达。两组间IOD均值比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。
二、凋亡检测结果
扁平苔藓组表皮和真皮浅层散在分布凋亡细胞,主要位于基底层和棘层,特别是基底液化区域更集中,部分表皮全层均可见大量凋亡细胞;健康对照组仅颗粒层有少量凋亡细胞。扁平苔藓组AI值明显高于健 康对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。
三、相关性分析
扁平苔藓患者TNF- 、Caspase-8的表达强度与其角质形成细胞的凋亡指数间均呈正相关,r分别为0.72、0.75,P值均<0.01;同时两者与Caspase-3的阳性表达也均呈正相关r分别为0.78、0.73,P值均<0.01。
讨论
扁平苔藓是一种原因不明确的累及皮肤黏膜的炎性丘疹鳞屑性疾病,其发生与细胞凋亡有关。我们运用TUNEL法检测扁平苔藓皮损中细胞的凋亡情况,发现扁平苔藓皮损中角质形成的细胞凋亡明显增多,与文献报道结果完全一致,且凋亡主要其中于表皮基底层和棘层,在基底液化区域尤为明显,故推测细胞细胞过渡凋亡可能在促进皮损处基底细胞液化变化中启到一定的作用。细胞凋亡时,DNA断裂早于DNA含量和细胞形成的改变,而TUNEL法正是以检测凋亡细胞的DNA断裂点来判断细胞凋亡,所以此法可以检测到处于凋亡早期的细胞,所以在部分扁平苔藓表皮各层发现有大量凋亡细胞。
Caspase分子的级联反应在凋亡过程中起着重要的介导作用,其中Caspase-3是凋亡反应中重要的执行者,无论是死亡受体途径还是线粒体途径都需要激活Caspase-3才能引发凋亡,所以Caspase-3常被作为判断凋亡的指标。本研究显示,扁平苔藓中Caspase-3阳性细胞主要分布于表皮,间接提示表皮细胞凋亡过度,与TUNEL检测的凋亡结果基本吻合。
TNF- 在体内人来源广泛,与其受体TNFRI结合,通过活化一系列信号传导因子,激活Caspase-8、3等分子,来引起靶细胞凋亡,其中Caspase-8是凋亡反应中是最重要的启动者,不仅参与死亡受体途径,也可以启动线粒体途径,进一步放大凋亡信号。
扁平苔藓表皮中TNFRI表达上调,靠近基底层表达水平更高。本实验显示,扁平苔藓皮损中TNF- 和Caspase-8表达上调,强度一致,TNF- 表达情况与丁政云等的报道结果吻合。我们还发现,两者表达强度均与皮损中角质形成细胞凋亡指数和Caspase-3的表达呈正相关,且二者阳性细胞和凋亡细胞都是主要位于表皮基底层和棘层,提示扁平苔藓中角质形成细胞和淋巴细胞产生的TNF- 与角质形成细胞表面的TNFRI结合,通过激活角质形成细胞中Caspase分子级联反应引起其凋亡。另外TNF- 还可以诱导淋巴细胞向真皮浅层大量浸润,加重了炎症反应,促进病情发展,如阻止TNF- 释放,抑制其活性,可能成为治疗扁平苔藓的新靶点。
(王娟,白莉,扁平苔藓皮损中肿瘤坏死因子 和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8、3的表达[J] 中安皮肤科杂志2012年12月第45卷第12期)