全世界约15%的夫妇不育,
男性不育占50%左右,其中60%以上精子发生减少的原因不清,认为有遗传变异存在[1] .近来发现Y染色体微缺失,主要是AZF基因缺失与之有关.我们采用多重PCR技术,对45例研究对象精液基因组DNA进行Y染色体微缺失检测,旨在从分子水平对男性不育病因作一些探索.
目的:探讨Y染色体微缺失与原因不明性
无精症、
少精症所致男性不育的相关性.
方法:特发性少精症18例、特发性严重少精症12例、特发性无精症5例及正常已生育健康男性10例作为研究对象和正常对照.应用多重PCR技术,对精液基因组DNA进行Y染色体上连续的18个序列标记位点检测.
结果:少精症18例中发现Y染色体微缺失2例,严重少精症12例中发现Y染色体微缺失3例.无精症5例和正常已生育男性10例均末发现Y染色体微缺失.缺失形式3种.
结论:Y染色体微缺失与精子发生障碍相关.
1 对象和方法
1.1 对象 2001-03/2001-11西京医院妇产科
不孕不育专科门诊患者35例.其中特发性少精症18例,特发性严重少精症12例,特发性无精症5例.平均年龄33(26~39)岁,婚后不育年限1.5~8(平均3.5)a.所有患者性功能正常,无生殖系统器质性病变及炎症、阻塞等.10例正常对照精液标本为西京医院妇产科实验室储存,平均年龄27.5(22~35)岁.所有研究对象在检测前抽静脉血检查染色体核型(G显带技术)、抗精子抗体(ELISA)及血清激素水平(卵泡刺激素、黄体激素、睾酮,放射免疫测定法),异常者均不列入研究对象.
1.2 方法 精子密度判断根据1992年WHO标准制定,采用北京伟力经贸公司WLKY-9000伟力彩色精子质量检测系统进行检测.研究对象禁性生活3d后,取精液检查,连续2次异常予以确诊.无精症:精液中未见精子;严重少精症:精子密度小于5×109 ?L-1 ;少精症:精子密度(5~20)×109 ?L-1 .精液基因组DNA提取采取氛氯仿抽提法.精液标本离心弃上清,生理盐水洗涤后,加入细胞稀释悬浮液、10g?L-1 SDS,3mol?L
-1 氯化钠、双蒸水和酚氯仿(V∶V∶V∶25∶24∶1),离心取上层,加无水乙醇离心,75mL?L-1 乙醇洗涤,双蒸水溶解DNA.紫外分光光度计及20g?L-1 琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度及含量.提取的DNA置-20℃保存.缺失筛查采用美国Promega公司生产的Y染色体缺失检测系统(Y chromosome Deletion Detection System,Versisn1.1Part#TM234),其包含有Y染色体上与精子生成基因最相关的18个已知序列标记位点引物对.同时扩增18个非多态序列标记位点短DNA片段(分别位于AZFa AZFb AZFc AZFd区域,Fig1).扩增产物长度为83~370bp,琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色观察.试剂盒提供对照梯度标准物.检测系统分A,B,C,D4组反应液,每组内均有一对照引物扩增X连锁的SMCX位点,以作为扩增反应效果和DNA完整性对照.另外设正常男性DNA阳性对照及空白阴性对照.如果测试样品不能扩增出Y染色体特定区域,则意味着测试样品Y染色体有该区域微缺失.初筛异常标本经2~3次PCR重复检测证实.PCR总反应体积25μL,循环条件:94℃2min,94℃1min,57℃30s,72℃1min,35个循环,最后72℃延伸5min,4℃保温.扩增产物在20g?L-1 琼脂糖凝胶,1×TBE缓冲液及5V?cm-1 电流条件下电泳.经UV-150紫外线透射分析仪照射后,复日科技FR-2000紫外与分析可见装置扫描成像.
2 结果
35例异常精液标本除5例无精子症外,余30例少精症中28例伴有精子活率低下,精子活率范围3.0%~46.6%,平均25.3%.10例对照男性其精子数量及活率正常.所有精液标本采用氛氯仿抽提法提出了精液基因组DNA,经多重PCR扩增,电泳显示特异性SMCX带(83bp),示多重PCR扩增反应有效,提取的DNA具有完整性.35例患者精液基因组DNA经多重PCR扩增检测后发现5例有Y染色体微缺失,缺失率14.3%,其中2例为少精症,3例为严重少精症.5例无精症患者和10例对照男性未发现Y染色体微缺失.缺失表现形式3种:1例AZFc(DAZ+SY157)+AZFb(SY130+SY128)缺失;1例AZFc(DAZ+SY157)+AZFd(SY152)缺失;余3例均为AZFc缺失(Fig1,Tab1).5例缺失患者均有AZFc缺失,无AZFa缺失,亦无AZFb和AZFd单独缺失.AZFc缺失片段各不相同,但包含有共同缺失片段DAZ(SY254,SY255,Fig1,2).
图1 略
表1 Y染色体微缺失患者缺失部位、片段及精子密度、活率 略
3 讨论
我们发现35例不明原因性无、少精症患者中有5例显示Y染色体微缺失,10例正常对照无一例发现微缺失,提示Y染色体微缺失与男性精子发生相关.Y染色体微缺失发生率报道不一[2,3] .Foresta等[4] 分析不育男性4800例Y染色体基因微缺失,发现无精症男性缺失率最高,其次是严重少精症和少精症.我们的结果只发现严重少精症缺失率高于少精症,5例无精症患者无一例发现微缺失,与无精症患者样本量少可能有关.我们研究表明,缺失最多的部位亦为AZFc区中的DAZ基因,且所有DAZ基因缺失患者均有共同缺失片段:DAZ基因簇中的SY255和SY254,提示此两基因参与精子的发生.
图2 略
关于Y染色体微缺失的机制说法不一,主要认为:①Y染色体在精子发生过程中,由于胚细胞快速分裂,与卵子发生过程相比具有更多突变机会;②Y染色体不能象常染色体一样进行DNA修复;③所有Y染色体基因都是单倍体,故一个基因缺失就能发生效应[3] .但也有学者持相反观点:认为Y染色体微缺失形成是一种随机事件,不依赖于Y染色体出现的背景,可能是其它遗传或环境因素所致,Y染色体微缺失是导致男性无、少精症的重要原因.
参考来源:《第四军医大学学报》2002年7月23卷14期;《Y染色体微缺失与男性不育相关》;刘芳 陈必良 苏明权 王德堂