目前对精子DNA碎片的研究正处于初步探索的阶段,且其具体发生机制尚未完全弄清。但现有的一系列研究结果显示,其在辅助生殖技术领域中仍显示出了巨大的预测价值。本文分析了精子DNA碎片发生机制、检测技术有关问题的研究现状,以及精子DNA碎片率增加对辅助生殖结局的影响。
1 精子DNA碎片种类和形式
从种类来源而讲,精子DNA碎片包括核DNA碎片和线粒体DNA碎片。有相关研究表明不育男性的精子细胞核内存在较高水平的DNA碎片率,且与临床妊娠率、分娩率呈负相关,并且Venkatesh等研究显示,不育男性患者精子细胞质内存在高发的线粒体DNA损伤;而从DNA碎片形式来讲,精子DNA碎片包括DNA单链碎片和DNA双链碎片。迄今为止,研究人员已经认识到的DNA链损伤形式包括,全基质模式、碱基缺失(形成无碱基位点)、碱基修饰(碱基氧化、烷基化等)、DNA交联等。一般情况下,DNA单链碎片较双链碎片更为常见,且在一定条件下,如果单链DNA碎片不能及时被修复,某些DNA单链碎片会进一步破坏形成DNA双链碎片,进而会造成DNA断链之间和DNA一蛋白质的相互缠绕而形成较大的“DNA 碎片”,这既反映出了DNA碎片的产生是一个动态、循序渐进的过程,也标志着精子DNA损伤的严重程度存在着差异性,其对男性生育能力造成的影响也有所不同。
2 精子DNA碎片化的发生机制
2.1 精子细胞核结构特点
作为男性的配子生殖细胞,精子是一种单倍体,故其DNA含量仅是体细胞的一半。在正常状态下,精子细胞除了合成少量功能蛋白外,基本上处于休止状态。与体细胞的核蛋白(主要是组蛋白)不同,精子的核蛋白主要为鱼精蛋白,后者是一种富含精氨酸和半胱氨酸的碱性蛋白。由于精子核DNA带有负电荷,能够与带正电荷的精氨酸基团之间形成特殊的氢键;另外,半胱氨酸之间可形成分子间二硫键而有利于染色质丝的排列稳定。由于以上原因,使得精子核染色质的密度要明显高于体细胞,精子头部体积“适当缩小”,生化性质也比较稳定,以致能够满足精子穿透卵细胞的能力。然而,也正是以上因素,导致精子细胞核DNA 自身修复能力以及应对内外界环境有害刺激的能力大大降低。另一方面,从生精细胞分化、产生出功能正常的精子是一个很漫长的过程,且受到多种因素的协调控制,如果机体暴露于某些有害因素环境中,也就更容易造成精子发生过程中的遗传物质损伤和结构功能异常。
2.2 精子DNA碎片化的发生机制
精子DNA碎片化发生的机制尚不完全清楚,但目前研究表明,主要与精子发生过程中遭受有害刺激因素后而弓l发的氧化应激有关,另外,还与精子发生过程中异常的染色体组装、精子的异常凋亡有关。
研究报告表明,氧化应激与人体许多疾病状态有关,包括衰老、动脉粥样硬化、癌症、肝脏疾病、风湿性关节炎、艾滋病、毒素、农药化学制品暴露以及男性不育等。据此可知,一部分男性不育症可能是伴随着身体其他疾病而出现的。由于机体内不同组织和细胞的组成成分、结构特性等存在较大差异,因此它们对氧化应激的敏感性和反应性也就各不相同。1979年Jones等首先提出,人类精子对氧化应激特别敏感,并推测其可能与男性不育相关,即精子暴露于过量的活性氧分子环境中,可造成其细胞质膜中多聚不饱和脂肪酸的过氧化,引起多聚脂肪酸中双键的破坏,而这些双键对于维持精子膜的流动性又是必不可少的,因此,氧化应激可导致精子细胞膜结构受损,并且还能够引起两种严重的“连锁反应”:一方面,氧化应激引起精子细胞膜结构受损,精子细胞的代谢功能受到抑制、甚至丧失,就可促进精子细胞的凋亡过程,引起精子细胞核碎裂,核DNA碎片增多等;另一方面,精子细胞膜的结构破坏,就会导致精子核DNA直接暴露于精浆中活性氧类物质中(主要是精浆中白细胞产生ROS),这时就会导致精子DNA遭受ROS的正面攻击而引起大范围的DNA单链、双链的断裂、破坏,引起精子遗传物质结构受损、功能缺陷而导致男性不育。在随后的实验研究中,将精子暴露于人工产生的ROS环境中培养一段时间后,可导致精子DNA多种形式的损伤破坏:包括碱基修饰、移码、缺失、产生无碱基位点、DNA链断裂、交联以及染色体的重排等。Smith等研究显示,与正常生育力男性相比较,精索静脉曲张不育患者的精子DNA碎片指数要明显高于前者,而且DNA碎片率指数与精液中ROS水平呈正相关。并且,在对上述患者施以精索静脉曲张结扎术后,精子DNA碎片率指数显著下降。由此研究人员推断,精子DNA损伤以及碎片的产生可能与精液中较高水平的ROS相关。但就其具体的发生机制,仍尚未完全弄清。
另外,氧化应激与人体的许多疾病状态有关,而且能够引起精子DNA的损伤、破坏、碎片率增高等。长期暴露于污染的空气、吸烟、吸毒等都会导致精子DNA的碎片化程度增加。同时,高热、工作环境温度过高、睾丸局部血液循环受阻也是导致其精子DNA碎片率增高的有害因素。
3 检测精子DNA碎片率的主要实验方法
3.1 末端转移酶介导的dUTP末端标记法(TUNEL):该方法于1993年由Gorczyka等首先提出,它是一种直接检测精子DNA损伤的方法。其原理是:精子DNA断裂是以其脱氧核苷酸链中的3'',5''-磷酸二酯键打开而产生5''-磷酸基团和3''-羟基为特征的一种损伤形式,并且在适当条件下具有一定的修复能力(断链的两端可重新连接),因此可利用末端转移酶将一段预先标记好的核苷酸连接到断裂DNA片段的3''-羟基端,然后在光镜下或荧光显微镜下观察精子DNA断裂的情况。与其他方法相比,该方法不需要经过对DNA的变性过程,简单便捷,而且能同时检测单链DNA和双链DNA的断裂情况,因此能够真实地反映出精子DNA的损伤程度。所以说TUNEL法是一种值得男科实验室推广应用的方法。
3.2 单细胞凝胶电泳(SCGE):又称为彗星实验,它是一种在单细胞水平上检测真核生物细胞DNA损伤的方法。该方法由Ostling和Johanson在1984年首先提出,其后经过研究人员的不断改进,逐渐成为一种快速、灵敏、简便的检测精子DNA损伤的方法,其原理为:当精子DNA 损伤时会出现不同大小的DNA 片段,经过去污剂和裂解液处理后,精子细胞核内的DNA碎片、大部分蛋白质以及其他细胞成分就会渗出细胞膜进入裂解液,然后损伤的DNA片段在电场力的作用下就会向阳极迁移,从而形成特征性的“彗星”样拖尾,用荧光染料染色后在荧光显微镜下进行观察,从而根据彗星的头尾长度和荧光强度来评估精子细胞DNA的损伤程度。后来,随着人们对精子DNA研究的不断深入,相继有研究报告指出,前者实验条件中的中性裂解液及其温度条件不能使断裂的精子DNA与其精核蛋白完全分开,而只能使小部分较小片段的双链DNA解离、并在电场力的作用下移出细胞核形成“彗星”样拖尾。随后经过研究人员的不断改进 ,即将电泳的条件由中性改为弱碱性,能更好地裂解精子细胞内的核酸、蛋白质等大分子物质,进而能够在电场力作用下充分地移出精子膜形成较真实的的彗星图像,反映精子DNA 断裂的实际水平。最近,Ribas-Maynou等采用碱性-中性双重彗星实验,不仅使检测结果的准确性显著提高,而且能够区分精子单链DNA碎片和双链DNA碎片。
3.3 精子染色质扩散实验(SCD):SCD 法首先由Ferndndez等在2003年提出。它的原理为,精子细胞经过酸变性、去掉核蛋白后,其DNA就会从染色体上解离扩散,如果精子核的DNA没有损伤(不形成DNA碎片),就会扩散形成特征性的光晕。相反,如果精子核内DNA受损生成碎片时,就不会产生这种特征性的光晕,因此可根据光晕的有无和大小判断精子DNA的碎片率水平。后来在2005年,Ferndndez等将其方法改进,形成一种Halosperm试剂盒,使用光学显微镜即可对结果进行观察,同时能够保持精子尾部的完整,从而有利于人们区分精子和圆形细胞等非精子成分。因此,与其他检测方法相比,SCD法检测结果的组内差异、组间差异相对较低,并且操作简便、费用低廉,现在正被国内外越来越多的实验室人员所认可和使用。
3.4 精子染色质结构分析(SCSA ):SCSA法已被当前世界范围内大多数男科实验室所认可采用,并用来评估男性生育力情况及预测体外受精和妊娠结局的关系。它的原理为:受损的精子DNA经过酸性溶液作用后容易变成单链,吖啶橙(AO)与双链DNA结合可发出绿色荧光,而与单链DNA结合发出红或黄色荧光,然后可通过流式细胞仪进行结果分析。SCSA法现被称为检测精子DNA碎片率的金标准方法。
然而,有研究人员指出,即使人们能够检测出精子细胞核内存在DNA碎片,那又能如何? 因为目前临床医务人员还不能“寻找”出一种特别有效的能够预防精子DNA碎片产生、以及精子DNA碎片产生后如何治疗等一系列针对性措施。因此也有研究人员提出,没有必要浪费人力、财力去检测精子DNA是否存在碎片,因为即使我们确定了精子DNA有损伤,也只能是“束手无策”。而Schlegel持有不同观点,因为如果男性患者精子存在亚临床损伤,含有较高的DNA碎片化指数,对医务人员来说,这些患者的不育原因也就找到了,而不是所谓的不明原因性不育。对于以上患者,即使临床医生不能提供特别有效的治疗方法,但是他们可以给患者一些相应的对症治疗,例如,药物抗氧化剂、必需微量元素补充治疗,指导患者避免有害环境、毒物暴露,改正不良生活习惯(吸烟、喝酒、工作压力、睡眠质量差等)等有益的辅助治疗措施。而这些对症治疗措施就足够能让一些患者从不明原因性不育的阴影中走出来而获得成功的妊娠结局。因此,对精子DNA碎片进行研究应该有其重要意义。而精子DNA碎片率大小与男性生育力究竟存在何种关系,有赖于对其进一步的探讨和研究。
(张帅,张云山,精子DNA碎片化在男性不育中的研究进展[J]山西医药杂志2012年10月第41卷第10期上半月:1005-1007)