据WHO统计,育龄夫妇中约有10 %~15 %
不孕不育,其中男性
少精、弱精、
无精子等不育因素约占40 %~50 %[1]。引起
男性不育的原因很多,如遗传因素、内分泌因素、环境因素,但尚有一部分无精子症及严重少精子症患者原因还不明确,多表现为生精障碍,国内外研究表明,其与Y染色体微缺失有关,男性原发性无精和少精症患者中大约有7.5 %~15 %存在Y染色体AZF(azoospermia factor)区微缺失[2]。分子流行病学研究结果显示,中国人原发性无精与严重少精症患者群体AZF区STS(sequence-tagged sites)微缺失率均高于17 %[3]。它是由于精子发生障碍而导致男性不育的最普遍的一种遗传因素[4]。本文对Y染色体微缺失相关基因、主要原因、主要检测方法聚合酶链反应(polymerase chain renction, PCR)及临床意义进行综述。
一、Y染色体微缺失
Y染色体是一条小的近端着丝粒染色体,约有6.0×107个碱基对。Y染色体不是人类生命所必需的,它大部分区域是隐性功能区,其中性别决定区(由SRY基因控制)被认为是Y染色体的主要区域。但随着在Y染色体上发现精子发生控制区,这个观点发生了改变[5]。
1.Y染色体微缺失主要候选区域—AZF区:1976 年Tiepolo 等[6]首次报道6例无精子症患者有Y染色体长臂6 区(Yq6) 的缺失,包括远端荧光区和与其相连的非荧光区,因此推测在Yq11上存在“Y染色体精子生成基因”,并由此揭开了研究Y染色体微缺失与男性不育关系的序幕。研究发现Y染色体长臂的5~6 区间有一个AZF位点,被分成3个与生育相关的功能区,AZF a区、AZF b区和AZF c区,由于这些区域包括一些影响男胚细胞发育和维持的基因和基因家族,故其可影响精子发生。最近Kent等[7]在AZF b区与AZF c区之间还发现了第4个AZF区-AZF d 区。有资料显示,在无精子症和严重少精子症的患者中,AZF 缺失约占3 %~29 % ,它是染色体异常导致无精子以外的第2个重要因素[8]。
AZF存在于Y染色体长臂远端(Yq11.23),其微缺失可以导致精子发生阻滞。睾丸活组织检查发现,微缺失发生于同一亚区时,精子发生阻滞在同一时相,反之,则阻滞在不同时相。一般认为AZF a区缺失的患者精子发生阻滞在青春期前阶段, 表现为唯支持细胞综合征(SCOS)和小睾丸;AZF b区缺失表现为生殖细胞成熟障碍,即睾丸内只见精原细胞和初级精母细胞,而精液中无精子;AZF c区缺失情况比较复杂,对于同一患者,一些生精小管内仅见支持细胞,而另一些生精小管内可见精原细胞、精母细胞、精子细胞甚至精子, 精液检查为严重少精,有时可见少量活动精子,但畸形精子数量明显增多;中等程度少精或精子数目正常但形态异常提示有AFZ d区微缺失[9]。
2.Y染色体微缺失的其他基因:精子发生是一个复杂的生理过程。生殖细胞从精原干细胞到精细胞进行有秩序的增殖、分化而产生精子, 受到大量基因调控。因此,除AZF 区外,Y 染色体长臂的SMCY 基因、短臂上的SRY、ZFY和TSPY基因也都与精子发生有关[8]。如果上述基因发生缺失或表达异常同样会造成精子发生障碍或性腺发育障碍, 故这些基因在临床上也有重要的意义。
3.Y染色体微缺失主要原因:(1)再发现象。即de novo 缺失(在患者男性直系亲属外周血分析中未见缺失)。这一缺失可能发生在其父亲精子发生过程中或在其早期胚胎发育过程中。(2)垂直遗传。主要发生在DNA 复制期,睾丸生殖细胞系缺失可产生有缺失的精子,如果这些精子使卵子受孕,将会产生Y染色体微缺失的个体,男性后代则继承其父亲生殖细胞中有缺失的染色体。(3)睾丸生殖细胞系中存在缺失的嵌合体。如父亲外周血淋巴细胞中未见缺失,而通过ICSI(intracytoplasmic sperm injection)的男性后代却有Y染色体微缺失,则说明嵌合体的存在[10]。
二、Y染色体微缺失的主要检测方法
由于Y染色体微缺失可以导致男性不育,故其微缺失的检测对患者的病因诊断和临床治疗及遗传咨询都是必要的[4]。但仅以临床查体和精液分析为基础的细胞遗传学检测不能确定Y染色体是否发生微缺失[11],而PCR可以使少量的单拷贝基因在体外大量扩增后直接观察,且缩短了检测时间。因此,一般应用PCR方法检测。1986年,Vergnaud建立了Y染色体基因微缺失图谱[12],为Y染色体基因分析创造了条件。接着,其他学者又列出了Y染色体上各DNA片段的PCR引物序列,为Y染色体精子发生基因的PCR检测带来了极大的方便。
1.常用的待扩增目的基因及位点:Y 染色体是男性特有的, 其上存在有精子发生相关基因。一些精子发生的候选基因在AZF区被发现,有些候选基因甚至被认为是精子发生的功能基因[4],因此一般选择对AZF区基因进行扩增。现在比较公认的AZF区的候选基因是AZF c区的DAZ(deleted in azoospermia)和AZF b区的RBM(RNA binding motif),但在PCR反应时,也可根据情况对其它两个区进行扩增。
AZF c区的最佳候选区为DAZ。1995年有人发现DAZ,并证明DAZ是人和猩猩所特有的,其专一地在睾丸内表达[13]。研究表明,DAZ的表达蛋白可与RNA或单链DNA结合,从而调节RNA或DNA的功能。目前已发现果蝇和小鼠体内也具有DAZ的同源基因,分别被命名为Boul基因和Dazh基因,这对为深入研究人类DAZ基因的特性和功能意义创造了条件。
AZF b区的最佳候选区为RBM,又名YRRM(Y chromosome RNA recognition motif)。1992年我国留英学者马昆(Ma Kun)[14]用特异性探针在50例核型正常的无精子或严重少精子患者中发现4例出现Yq11.23区域的基因微缺失,认为这4人的无精子可能由这些基因微缺失造成的。随后,研究发现了MK5和MK29,均为1.9 kb左右,并证明了MK5高度专一地在人类睾丸内表达。应用基因文库进行基因结构分析发现MK5和MK29均有编码含RNA识别位点蛋白质的序列,因此将MK5和MK29分别命名为YRRM1和YRRM2,提示在Y精子发生初期,该基因可能参与RNA的形成、加工和翻译等过程。
根据Vogt等[9]对AZF区定位结果显示AZF a区、AZF b区、AZF c区的长度分别约为782 kb、3. 2 Mb及3. 5 Mb,且有资料显示AZF a区缺失占全部AZF缺失的4.9 %[15]。在试验及临床检测中一般进行扩增的位点是SY84,SY86(AZF a区)、SY127,SY134(AZF b区的RBM基因)、SY254,SY255(AZF c区的DAZ基因),由于AZF d区较其他三个区发现的晚,一般在检测中不进行,如果进行,SY152是选择位点。研究发现,SY152位与DAZ基因的近侧区,单一SY152缺失可以导致精子发生成熟期的阻滞,在睾丸活检中不能发现精子[16]。在检测中也可以根据实际情况选择相应的其它位点进行扩增,如SY82(AZF a区),SY143、SY133、SY128、SY129(AZF b区),SY154、SY242、SY239(AZF c区),SY145(AZF d区)。
目前Y染色体微缺失检测绝大多数是提取患者外周血,进而分离出淋巴细胞作为样本,亦有研究者取精液或单个精子,极少研究者同时取精液和外周血。因为外周血检测方法相对简便、取材容易,且一般认为外周血淋巴细胞基因组DNA与胚细胞如精子基因组DNA相同[17-20]。但无论采用什么方法,患者在检测前都要进行详细的检查,包括临床检查、生育力及家族史,以便排除其他无精症的原因[11]。
在进行Y染色体微缺失检测时,即可进行单重PCR也可进行多重PCR。单重PCR时一般选择对AZF b区或AZF c区进行特定位点扩增,而多重PCR时一般对四个区全部进行扩增,大约10~18个位点,且AZF c区的DAZ及AZF b区的RBM所占比重较大。在多重PCR时,也可以根据实验需要进行分组扩增。
2. PCR检测主要注意事项:Y染色体PCR检测与一般PCR过程相似,都经历了高温变性、低温退火、适温延伸,但有的学者认为在反应体系中除了正常内参照、阳性参照、阴性参照之外还应用水来做空白对照,以排除假阳性或假阴性的可能[11]。也有资料显示,虽然水样反应体系包含了所有的反应必须底物,却易于被污染[21]。
由于检测中不可避免出现误差,故在结果观察时,应保证连续3次以上PCR反应都没有相应条带出现,才说明其相应基因发生微缺失[11]。
在研究的资料中,Y染色体微缺失发生频率有较大差异,造成这种差异的原因有多种。可能是由于,(1)病例选择。对于病例选择严格,即仅对不明原因的无精子症和严重少精子症患者进行检测,缺失率较高。(2)实验方法和试验条件。实验方法和试验条件的好坏,直接影响到结果的可靠性。(3)检测区域。检测不同区域也会得出不同的缺失率;(4)人种差异[12]。
三、Y染色体微缺失检测的临床意义
1.确定部分无精子症患者病因:在男性不育的患者中尚有约11 %病因不明,称为特发性不育(idiopathic infertility) ,其中最常见的表现是无精子和严重少精子[4],国内外学者认为其与Y染色体微缺失有关。
2. 减少病人痛苦及提高辅助生殖几率:对于无精子症和严重少精子症患者进行Y染色体微缺失的检测是很必要的。如果患者是AZF c区或部分AZF b区缺失,则有50%的几率可以检测出精子,但如果是整个AZF b区缺失,则检测出成熟精子的可能性几乎为零[22]。有报道表明如果患者发生缺失的部位是在AZFa 区,则没有精子形成的可能[23]。有研究发现,AZF c区缺失的患者54%表现为无精症,46%表现为严重少精症[23];AZF a、AZF b、AZF c区同时缺失,则一定为无精症;AZF a区完全缺失或AZF b和AZF c两区同时缺失,96%表现为无精症,4%表现为严重少精症。因此,对于没有可能形成精子的患者就不需要进行辅助生殖,可使患者身体和精神伤害降低,经济负担减少。但对于有精子形成可能的患者,就可以尝试通过(testicular sperm extraction,TESE)进行ICSI或者(in-vitro fertilization,IVF)。
虽然AZF c区缺失患者有可能形成精子,但随着时间的推移,患者的精子量会逐渐减少,那么如果在早些时候冻存患者精液,在其想生育时就可以避免睾丸穿刺的痛苦,而且精液质量也较高[22]。
还有资料显示,对于无精子症患者进行Y染色体微缺失检测可以避免睾丸基因表达分析,而直接找到睾丸组织中成熟精子[4]。
3.提供遗传咨询:随着现代医学的发展,异常基因的垂直传播越来越被人们所接受,故那些要选择辅助生殖夫妻的男性后代将遗传其父亲有微缺失的异常性染色体,甚至会产生更多的微缺失而导致更严重的睾丸表型[11]。因此,很多学者建议应向这些患者及其配偶提供遗传咨询服务,使他们知道后果并做出选择,是否进行辅助生殖;是否在进行植入前直接选择女婴[24]。
总之,Y染色体微缺失的检测非常必要,它不仅可以被定义为无精子症的原因,还可以对那些无精子症及严重少精子症的患者及其男性后代提供大量的最适合临床治疗的宝贵信息[22]。
四、发展前景与新的挑战
最近有学者提出,从患者口腔粘膜中提取DNA快速有效[25],这样不仅可以缩短检测时间,也可以降低患者痛苦,使其损伤减少。
现在对于Y染色体AZF四个区的微缺失所表现的疾病类型有所了解,随着科学技术的发展,对相应疾病表现类型进行相应区段、甚至相应位点的扩增,这样即降低了患者经济负担,又可以对病因做到基因水平上的准确定位。
现在患者目的基因一般都来自于外周血淋巴细胞。如果外周血基因组DNA与胚细胞如精子的基因组DNA表达一致,则外周血可以代替胚细胞进行检测,但是如果二者表达不一致,那就说明单纯检测外周血是不可信的,进行ICSI 治疗的患者有必要进行胚细胞DNA 的Y染色体微缺失检测,以明确是否携带有Y染色体微缺失[25]。这就需要寻求一种新的、快速、方便、有效的方法来进行检测。
对于Y染色体微缺失的检测,不仅对临床诊断方法的发展起到推动作用,还帮助人们增长对于精子发生的知识,也许存在其它可以导致精子发生障碍的基因因子或未知精子发生基因[4],故现在还不能从真正意义上了解和掌握与精子发生相关基因的生化功能,不能明白Y染色体微缺失的基因型和表现型之间的关系。
随着科学的发展,技术的进步,对Y染色体微缺会有更深入的了解,相信以上这些问题都会得以解决。
参考来源:《中国生育健康杂志》2007年4月18卷3期;《Y染色体微缺失与男性不育》;韩潇 综述 刘睿智