男性生殖道的感染是引起
男性不育的重要的因素,在症状或非症状男性生殖道感染中,起关键作用的两种生物体是解脲支原体(mycoplasma urealytium;MU)和沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis;CT)。近年来,关于MU感染与男性不育的关系已有大量的报道,但CT感染对精子及男性不育的影响报道不多[1~3], CT感染引起男性不育的机制仍不清楚。据WHO报道,每年全球约5亿人新发性传播疾病,其中的18%是由CT感染造成[4,5]。在女性中,年轻、性活跃者是生殖道CT感染的好发人群,在CT的传播中具有重要作用;在男性中,泌尿生殖道CT感染率不易确定,其原因是CT感染不易作微生物学检查或为无症状者。细胞凋亡(apoptosis)是细胞在胞外或胞内信号诱导下发生的主动自杀死亡过程,是调控机体发育、维护内环境稳定、由基因控制的细胞主动死亡过程。关于精子凋亡与男性不育的关系已有报道[6]。为明确CT感染引起男性不育的机制,于2007年对精液CT感染与精子凋亡之间的关系进行了探索。
目的: 探讨精液沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)感染与精子凋亡的关系,为研究男性不育提供新思路。
方法: 沙眼衣原体的检测用免疫层析法,采用瑞-姬染色精子,观察精子形态变化;用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的脱氧核苷酸原位末端标记法(TUNEL)检测凋亡精子。
结果: 精液CT阳性组精子凋亡率(33.03±14.98)%,正常对照组精子凋亡率为(9.68±2.78)%,组间差异显着(P<0.01)。
结论: 精液CT感染导致精子凋亡率增加,CT感染可能是男性不育的重要原因之一。
1 材料与方法
1.1 研究对象
正常对照组15例,有正常生育史,身体健康,精液CT检测阴性,精液常规正常的自愿捐精子者;年龄24~32岁,平均(27.73±2.20)岁。CT阳性组57例,不育门诊就诊者,为婚后同居2年以上,有正常性生活,未采用任何
避孕措施,睾丸、附睾、内分泌、染色体等检查无异常;精液CT检测阳性,年龄24~40岁,平均(28.81±3.31)岁,不育年限2~10年,平均(4.37±2.70)年,其配偶检查无异常。
1.2 试剂
TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒由南京凯基生物技术有限公司提供,CT快速免疫检测试剂盒由英国Unipath公司提供,1×Earle’s和10×Earle’s液由Sigma公司提供,percoll原液由南京凯基生物技术有限公司提供,TritonX100由北京拜尔迪生物公司提供。
1.3 研究方法
所有研究对象均禁欲3~5 d,手淫法收集全程精液于无菌玻璃容器中,置于35 ℃恒温恒湿箱中液化。取液化后的精液2 ml加入底部有2 ml 45%Percoll液的离心管中,2 000 r/min离心10 min,精液细胞主要沉积于精浆和45%Percoll液之间,于精浆与45%Percoll液之间用移液器取50 μl×5次精液沉淀入另一组离心管中,加入2 ml生理盐水,充分混匀;1 500 r/min离心10 min弃上清液,加入生理盐水2 ml;充分混匀后,1 500 r/min离心10 min,弃上清液,加入生理盐水2 ml;充分混匀后,1 500 r/min,离心10 min弃上清液,加入3 ml生理盐水,充分混匀,配成一定浓度的细胞悬液。取制备好的精液细胞悬液50 μl分别滴加在普通洁净的玻片(瑞姬染色用)和多聚赖氨酸防脱玻片(TUNEL时用)上,用采血针推平,弃去多余的细胞悬液,平放、自然凉干。
1.4 CT检测
取液化后的精液1~2 ml,1 500r /min离心10 min,取沉淀,按照试剂盒说明书进行操作。
1.5 常规形态学染色
取制备好的普通玻片精液细胞样本,浸入瑞-姬染液中1 min,倒入等量pH6.9的PBS缓冲液,再染10 min,自来水冲洗,自然凉干后用光学树脂封片,置油镜下检查并拍照。
1.6 TdT介导的TUNEL法检测凋亡精子
取已制备好的多聚赖氨酸防脱玻片精液细胞样本浸入固定液,室温15~25 ℃固定15 min~1 h;-20 ℃的乙醇中放置2 h;PBS漂洗3次,每次5 min;浸入封闭液,室温15~25 ℃封闭10 min;PBS漂洗3次,每次5 min;浸入通透液中,冰上(2~8 ℃)促渗2 min。PBS漂洗两次,样本周围用吸水纸吸干;每个样本滴加50 μl TdT酶反应液,加盖玻片37 ℃避光湿润反应 60 min;PBS漂洗3次,样本周围用吸水纸吸干;滴加50 μl StreptavidinHRP工作液,加盖玻片37 ℃湿润避光反应30 min;PBS漂洗3次;滴加50 μl DAB工作液,室温显色反应10 min;PBS漂洗3次,光学显微镜下检测及拍照。
1.7 统计学处理
采用SPSS 12.0统计软件包进行χ2检验,结果用(x±s)表示。
2 结 果
2.1 精子周亡率
观察精子头尾部,计数凋亡精子,统计凋亡率(计数500个精子,计算凋亡精子数占总精子数的比例),正常对照组精子凋亡率为(9.68±2.78)%,CT阳性组精子凋亡率达到(33.03±14.98)%。
2.2 TdT介导的TUNEL法检查凋亡精子
随机观察正常对照组和CT阳性组精液标本,凋亡精子头部呈棕黄色(图1~4),未凋亡精子不着色。
2.3 瑞-姬染色检查凋亡精子 凋亡精子染色质固缩(图5),核边集、呈新月状或块状小体(图6)。
3 讨论
CT是一类专性细胞内生长、有独特发育周期的原核细胞型微生物,很少从正常男性尿道中分离出来,但被认为是非淋菌性尿道炎(NGH)、附睾炎和慢性
前列腺炎的主要病因之一,其对男性生育功能的影响已引起了人们的关注。研究结果显示,CT阳性组和正常对照组精子凋亡率分别为(33.03±14.98)%和(9.68±2.78)%,组间差异显着,表明精液CT感染导致精子凋亡率增加。CT感染可刺激巨噬细胞分泌IL1、LI6及TNFα等细胞因子[7,8],而TNFα是启动细胞凋亡的重要细胞因子;同时,TNFα增高后使转移单电子的还原型辅 图1 CT阳性组
少精子组(TUNEL法,酶Ⅱ氧化酶含量增多,产生一系列的活性氧化物质(ROS)。过量的ROS,一方面可使精子线粒体内、外膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,使膜的脂质排列松散,内膜脊减少,ATP合成降低;另一方面过量ROS还可引起精子核的DNA发生断裂,导致精子凋亡的增加。Darville等[9]研究小鼠生殖道抗CT感染机制,发现在抗CT感染的宿主免疫应答中存在细胞介导免疫。Spadafora[10]研究证实生精细胞通过CD4分子介导免疫后,具有自发摄取外源性DNA能力,精子与外源性DNA相互作用,刺激内源性核酸导致类似凋亡的细胞死亡过程。
细胞凋亡(apoptosis)是多细胞生物普遍存在的细胞死亡形式之一。有研究显示,在生长发育、组织代谢和一些疾病等许多生理和病理过程中,凋亡都发挥着极为重要的作用。目前检测凋亡的方法很多,其中原位末端标记技术TUNEL法是分子生物学与形态学相结合的研究方法,可对完整的单个凋亡细胞或凋亡小体进行原位染色,能准确反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征。DNA裂解为许多单或寡核苷酸片断是细胞凋亡的主要生化标志。由于正常的、或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,故很少能够被染色[11]。应用TdT介导的TUNEL法检测正常对照组和CT阳性组精液标本,凋亡精子呈棕黄色,而未凋亡精子不着色。在应用TdT介导的TUNEL法检测凋亡精子的同时,应用常规瑞-姬氏染色法从另一角度检测凋亡精子,发现凋亡精子核染色质固缩并核周聚集,呈境界分明的新月形或块状小体;胞质起泡,胞质嗜酸性增强等形态结构改变,与熊承良等[12]报道一致。万长春等[13]研究表明,由于常规形态学方法不能早期发现凋亡细胞核与细胞器的改变, 故凋亡细胞百分率常规形态学染色法低于TUNEL 法, 但二者差异不显着(P>0.05)。
研究表明,精液CT感染导致了精子凋亡率增加,CT感染可能是导致男性不育的重要原因之一。
参考来源:《贵阳医学院学报》2009年6月34卷3期;《沙眼衣原体感染与精子凋亡关系的初探》;杨丹,郑立宏,高晓勤,石家齐