一氧化氮(NO)具有自由基化学性质和多种生物功能。NOS(nitric oxide synthase)广泛存在于人类生殖系统各组织,参与男性生殖系统功能的调节,如精子的发生、成熟及精原细胞凋亡等。NO通过调节睾丸血供及激素分泌、影响精液质量,降低精子细胞的运动能力,影响生殖功能。 关于
男性不育患者NO含量与生精细胞凋亡的关系目前报道极少,我们检测80例男性不育患者精浆NO的含量,观察NO的含量与生精细胞凋亡的关系,旨在进一步探讨男性不育发生的机制。
目的:探讨在男性不育中精浆NO含量对生精细胞凋亡的影响。
方法:应用硝酸还原酶法测定80例男性不育患者和62例正常有生育能力的健康男性(正常对照)精浆NO的含量;应用TdT介导的原位末端标记法检测15例男性不育患者、12例精浆NO的含量超过135 μmol/L的不育患者和15例正常健康男性的生精细胞凋亡情况;电镜观察不育患者生精细胞凋亡的超微结构变化。
结果:不育组与正常对照组精浆 NO含量分别为(107.8±25.9)和(76.5±16.4) μmol/L,差异极显著(t=8.34,P<0.01);15例正常生育组精浆NO含量为(76.7±10.4) μmol/L,生精细胞凋亡率为(3.8±1.3)%;15例不育组NO含量为(112.7±14.3) μmol/L,生精细胞凋亡率为 (4.7±1.9)%;12例不育组精浆NO含量高(>135 μmol/L)者的生精细胞凋亡率为(16.3±4.0)%. 不育组精浆NO含量和生精细胞的凋亡率均高于正常对照组(P<0.05). 不育组精浆NO含量超过135 μmol/L者的生精细胞凋亡率与正常对照组比较两者差异极显著(P<0.01)。 电镜观察发现,不育患者生精细胞出现核染色质浓缩、电子密度升高、核膜折叠、核裂解、形成凋亡小体等一系列变化。
结论:NO含量异常升高使生精细胞凋亡增加而降低生育能力。
1材料和方法
1.1材料
199805/200303泰安市各医院及章丘市人民医院收治的男性不育患者80例,年龄24~41(平均29.3±3.1)岁,婚龄2~12(平均5)a. 育龄夫妇结婚2 a以上,性生活正常,双方均未采取任何
避孕措施,无严重躯体性疾病;排除隐睾症、腮腺炎、内分泌系统疾病,无接触放射线等因素所致的不育;女方无明显不育因素。正常男性生育组62例,身体健康,有正常生育史,无生殖道疾病,精液常规正常,年龄23~39(平均28.3±3.0)岁。检测病例禁欲3~5 d,手淫法取精液于洁净容器中,置37℃恒温箱中待液化后进行检测。
1.2方法
1.2.1NO含量检测用硝酸还原酶特异性将NO3还原为NO2,通过显色深浅测其NO2浓度的高低,间接反映NO的水平. 操作过程:取待检精液0.1 mL,然后严格按照试剂盒说明书专人操作。用分光光度计(上海第三分析仪器厂生产)于550 nm,0.5 cm光处,测定样品的吸光度A值,根据下列公式计算NO含量。 NO(μmol/L)=(测定管的A值-空白管的A值)/(标准管的A值-空白管的A值)×100 μmol/L×样品的稀释倍数. NO测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.2.2生精细胞凋亡检测取液化的精液2 mL缓慢加入到底部已有2 mL 450 mL/L percoll液的试管中,2000 r/min,离心20 min,取精液与450 mL/L percoll分离液交界处的细胞层,加入等量的生理盐水混均,1500 r/min,离心10 min,弃上清,沉淀用生理盐水配成1∶5浓度的细胞悬液。取细胞悬液一式两份各10 μL,一份涂在干净的玻片上(细胞形态观察用),另一份涂在有多聚赖氨酸的玻片上(TUNEL检测用),剩余细胞悬液放入戊二醛固定液中,用于电镜观察。另取一张已制备好的细胞涂片进行HE染色,镜检。TdT介导的原位末端标记法检测凋亡细胞:按照试剂盒说明书专人操作。细胞凋亡试剂盒购自南京建成生物工程研究所; 镜下凋亡细胞的核中有棕褐色颗粒,非凋亡细胞用苏木素染为蓝色。细胞体积缩小,致密染色质聚集,断裂成核碎片,形成膜包裹性的凋亡小体。取戊二醛固定的细胞,经磷酸缓冲液冲洗,饿酸固定,乙醇梯度脱水,用Epon812树脂浸透包埋,LKB型超薄切片机切片,醋酸铀和柠檬酸铅双重染色,在透射电镜(JEM1200,日本)下观察。
统计学处理: 应用SPSS 10.0统计分析软件,进行方差分析和t检验。
2结果
不育组与正常对照组精浆 NO含量分别为(107.8±25.9)和(76.5±16.4) μmol/L,差异极显著(t=8.34, P<0.01)。 分离的生精细胞出现细胞核固缩,在核周聚集,出现境界分明的新月形或块状小体。凋亡的生精细胞在凋亡的初始阶段出现核膜间隙增宽,核电子密度增高,核膜与胞膜分离(Fig 1A);核膜折叠,互相融合(Fig 1B);胞膜与核膜裂解,核移外吐(Fig 1C)。
不育伴NO含量升高(>135 μmol/L)患者12例(C组)生精细胞的凋亡率明显高于A组(15例正常有生育能力的健康男性)和B组(15例不育患者)(P<0.01);B组与A组间有显著性差异(P<0.05, Tab 1)。不育患者精浆中NO的含量与生精细胞的凋亡率呈正相关(r=0.85, P=0.001)。提示NO的浓度对精子的形成有一定影响。表1NO含量与生精细胞凋亡率(略)
3讨论
eNOS位于所有生精阶段的间质细胞和支持细胞胞质。而在附睾和输精管上皮细胞中也发现有eNOS分布。 正常生精细胞中未发现有eNOS的分布,但在凋亡的精母细胞中有高浓度的eNOS表达。本结果表明,男性不育组精浆NO含量明显升高者生精细胞凋亡率与正常对照组比较差异极显著(P<0.01)。相关分析发现不育组精浆NO含量与生精细胞凋亡率呈正相关(r=0.85, P=0.001)。提示NO含量异常升高使生精细胞凋亡增加从而降低生育能力。NO通过脂质过氧化作用诱导生精细胞凋亡;NO能与睾丸生精细胞中的含铁酶相互作用,抑制生精细胞线粒体呼吸和能量产生;抑制与DNA合成有关的酶,使DNA合成减少;直接启动p53的表达。
电镜观察发现,男性不育患者生精细胞出现核染色质浓缩、电子密度升高、核膜折叠、 融合或裂解等一系列变化。对男性不育患者生精细胞的超微结构的观察,可进一步了解其不育的发生机制,对临床诊断和治疗提供病理形态依据具有重要的意义。
参考来源:《第四军医大学学报》2004年10月25卷19期;《男性不育患者精浆NO的含量对生精细胞凋亡的影响》;于爱莲,柳雅玲,张风雪,李亚鲁,赵英会