【摘要】目的:研究10种中草药对痤疮致病菌的体外抑菌活性。方法:制备10种中草药提取物,采用牛津杯抑茵圈法定性检测中草药对金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌的抑菌活性,然后通过2倍稀释法定量检测其最小抑茵浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果:10种中草药提取物中大黄、黄柏、丁香、姜黄4种中草药对两种致病茵均有抑菌作用;其中大黄的抑茵效果最好,对金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌的最小抑菌浓度分别为3.125、6.25 mg/mL,最小杀茵浓度分别为6.25、12.50 mg/mL。
【关键词】中草药;金黄色葡萄球菌;痤疮丙酸杆菌;体外抑茵实验;最小抑菌浓度
痤疮是一种皮脂腺的慢性皮肤疾病,痤疮的主要致病菌是痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌,目前抗痤疮药物活性评价主要考察对这两种菌的抑菌作用,减少皮肤毛囊中痤疮主要致病菌的数量是祛痘类化妆品的主要途径之一。
中草药是我国传统医学的中药组成部分,主要由植物的根、茎、叶、果构成。目前我国各地常使用的药用植物达5000种左右,把各种药材相配伍而形成的方剂,更是数不胜数。中草药价格低廉,资源丰富,含有多种活性成分,其富含的活性物质毒副作用小,在人体皮肤上产生不良反应机会少。近年来,安全、绿色、天然的中草药植物作为祛痘化妆品的主要功效添加剂已成为一种流行趋势。
实验前,对国内近20年涉及“中药”、“外用”、“痤疮”的文献报道进行调研,选择10种常见的中草药作为本实验研究对象,即大黄、艾叶、丁香、黄柏、苦参、蒲公英、蛇床子、仙鹤草、茵陈、姜黄,将10种中草药分别对金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌进行体外抑菌实验和最小抑菌浓度测定,旨在筛选抑菌活性强的中草药,为今后祛痘化妆品开发中草药添加剂提供依据。
1 材料
1.1 药材 大黄、艾叶、丁香、黄柏、苦参、蒲公英、蛇床子、仙鹤草、茵陈、姜黄,购于北京同仁堂药房。
1.2 菌株 痤疮丙酸杆菌标准菌株ATCC11827、金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC100817,广东微生物菌种保藏中心提供。
1.3 仪器 UV2300紫外可见分光光度计,上海天美有限责任公司;BS21S精密电子天平,德国赛多利斯天平有限公司;LS-B
1.4 试剂 痤疮丙酸杆菌培养基:脑心浸液培养基;金黄色葡萄球菌:牛肉膏培养基,均购于北京陆桥技术有限公司。
2 方法
2.1 培养基的制备 培养基按常规方法配制,调pH值为7.1~7.2。将培养基于锥形瓶中密封好后,放入灭菌锅中于
2.2 中草药供试液制备将中草药放入烘箱中,于50%处理12 h,然后分别准确称取
2.3 菌悬液的制备 将标准菌株分别接种培养增菌,在常规培养条件下培养24 h(痤疮丙酸杆菌用厌氧手套箱培养48 h),吸取菌液用培养基稀释调整为0.5个麦氏比浊单位(约为1.5×108 CFU/mL),将菌悬液用培养基继续稀释,用麦氏比浊仪将调整为1×106~105 CFU/mL,备用。
2.4 抑菌圈测定 根据参考文献,对实验方法进行改良。在无菌操作条件下,分别取上述菌悬液,用涂布棒均匀涂抹在培养基上。再用无菌镊将牛津杯轻放在凝固的培养基表面,轻压牛津杯使接触良好。用一次性注射针吸取供试液于牛津杯中,37qC培养箱培养24 h后取出(痤疮丙酸杆菌用厌氧手套箱培养48 h),用卡尺准确测量各培养皿中供试液有效抑菌圈的直径。各样品重复3次。另外配制对照组:空白对照组(培养基)、阴性对照组(培养基、菌悬液、无菌水)、阳性对照组(培养基、菌悬液、红霉素),来观察细菌的生长情况、培养基和中草药对细菌生长的影响。
2.5 最小抑菌浓度(MIC)测定 采用试管2倍稀释法,测定各中药供试液最小抑菌浓度(MIC)。在2.4中对两种致病菌均有抑菌效果的中药供试液用液体培养基依次稀释10、20、40、80、160、320、640、1280和2560倍。即最终药液浓度分别为l00 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL、3.125 mg/mL、1.5625 mg/mL、0.7825 mg/mL、0.3913 mg/mL。在1 mL的稀释液中加入0.1 mL的菌悬液。并设无药菌液对照管、纯中药对照管和阳性对照管。
将在MIC测定中,未见细菌生长的各管培养物中吸取0.1 mL涂布于固体培养基上,
3 结果
体外抑菌实验结果表明,空白对照组培养基澄清,说明培养基实验过程中没有被污染,对实验结果没有干扰。阴性对照组无抑菌圈产生,说明本实验结果有效。所选10种中草药对金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌呈现部分抑制作用,如表l所示。其中大黄和黄柏对金黄色葡萄球菌的抑菌直径为26.63、
最小抑菌浓度测定结果,通过2.4抑菌圈实验筛选出大黄、丁香、黄柏、姜黄4种对金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌均有抑制作用的中草药作为研究对象。由表2、表3可知,4种中草药受试液对两种痤疮致病菌的抑制作用程度不同,其中对金黄色葡萄球菌的抑菌程度依次为大黄3.125 mg/mL、黄柏12.5 mg/mL、姜黄25.0 mg/mL、丁香50.0 mg/mL;对痤疮丙酸杆菌抑菌程度依次为大黄6.25 mg/mL、黄柏25.0mg/mL、丁香25.0 mg/mL、姜黄50.0 mg/mL。在MIC的测定基础上,对4种中草药的最小杀菌浓度(MBC)进行测定,其中对金黄色葡萄球菌的杀菌程度依次为大黄6.25 mg/mL、黄柏25.0 mg/mL、姜黄25.0 mg/mL、丁香100.0 mg/mL;对痤疮丙酸杆菌杀菌程度依次为大黄6.25 mg/mL、黄柏25.0 mg/mL、丁香25.0 mg/mL、姜黄50.0 mg/mL。所以,所测试的中草药中,大黄对金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌均具有最好的抑菌效果和杀菌效果。
4 讨论
痤疮丙酸杆菌是丙酸杆菌属的小杆菌,是定居于人类皮肤毛囊皮脂腺滤泡中的最主要的微生物。痤疮丙酸杆菌能产生很多胞外酶和特异的炎前因子,将皮脂内的甘油三脂分解为游离脂肪酸、透明质酸酶等,促进皮脂分泌,促使金黄色葡萄球菌等繁殖,从而引起炎症性丘疹、脓疱。痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌与痤疮发生的多个环节中都有紧密的关系,能诱发或加重痤疮症状,所以,用祛痘类化妆品减少皮肤毛囊中的痤疮主要致病菌的数量是目前预防痤疮感染和痤疮患者日常护肤的主要途径之一。
本试验选用痤疮主要致病菌痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌作为试验菌,考察了10种中草药对以上两种致病菌的抑菌活性。结果表明,10种中草药提取物通过抑菌圈法初筛后发现,只有大黄、丁香、黄柏、姜黄4种中草药对两种菌均有抑菌活性,其中大黄对金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌的抑菌直径分别为26.63、
本实验采用中草药煎剂测定其对痤疮致病菌的抑菌效果,实验所需设备简单,操作方法简便,可以在较短的时问内完成大量中草药的筛选。在试验过程中对各种操作细节严格加以控制,定量准确,故其结果相对较为可靠,可作为深入研究的依据。但是由于本实验主要研究中草药的体外抑菌效果,尚缺乏临床验证,药物在人体皮肤上的作用机制比体外相对复杂,所以作为祛痘化妆品作用于人体皮肤时能否达到与体外相同的效果,有待进一步验证。
现代药理学的研究证明,许多中草药都有较好的抑菌、杀菌作用。本实验研究以我国丰富的中草药为原料,选用的是安全性高并具有清热解毒之功效的中草药,本实验结果从一个侧面说明中草药对两种受试菌具有一定的抑制作用。其临床应用前景乐观,值得研究开发和利用。
(陈志蓉,董银卯,孟宏,邳楠,10种中草药提取物对痤疮致病菌的体外抑菌活性研究[J]中医药学报,2011年第39卷第6期:24-26)