类风湿关节炎(rhrumatoid arthritis,RA)是一种以慢性、对称性、多关节滑膜炎为特征的自身免疫病,由于抗原驱动和T细胞介导,进而活化其他免疫细胞及滑膜成纤维细胞,促使多种致炎性细胞因子产生增多,引起滑膜炎、血管翳并破坏骨及软骨,导致关节畸形。因此,抑制T细胞的活化才能阻断RA的免疫反应,有效控制病情及疾病发展。T细胞的共刺激分子是保证T细胞活化的关键,其中CD28和细胞毒T淋巴细胞相关抗原(CTLA)-4是通过这种正性和负性共刺激信号调节免疫应答的关键受体之一,通过与抗原递呈细胞上的B7(CD80,CD86)结合,在介导免疫活性细胞间的信号传递、调节机体免疫功能方面起着重要的作用。CTLA-4与B7分子的亲和力远高于CD28和B7的亲和力,对CD28介导的T细胞活化有较大的抑制作用。国内外研究发现CTLA-4的表达水平或功能的降低使自身免疫性T细胞克隆增值,并导致自身免疫的发生,在多种动物模型进行的临床前研究表明,重组人CTLA-4抗体融合蛋白(rhCTLA-4Ig)可以有效治疗一些自身免疫性疾病和抗排异作用。因此我们应用rhCTLA-4Ig治疗RA患者,观察其临床疗效,并且检测其对血清
肿瘤坏死因子(TNF)- 和趋化因子CX3CL1水平影响。
1 对象与方法
1.1 研究对象:44例中重度RA患者为我院风湿免疫科门诊及住院患者,其中男性5例,女性39例,年龄26~64岁,平均(48±9)岁。纳入标准:①符合1987年美国风湿病学会(ACR)RA分类标准,ACR功能状态分类为Ⅱ~Ⅲ级;②用药前疾病活动的判断指标为:肿胀关节数(SJC)≥3个(计数66个关节),同时压痛关节数(TJC)≥6个(计数68个关节),红细胞沉降率(ESR)≥28mm/1h,或者C反应蛋白(CRP)≥12mg/L;③年龄18~65岁;④允许口服波尼松(≤10mg/d,或相当剂量的其他糖皮质激素)和非甾体抗炎药(NSAIDs),但在基线期前其剂量稳定至少4周;⑤停用改善病情抗风湿药(DMARDs)5个半衰期以上。排除标准:①合并其他免疫系统疾病,心血管、肾脏、肺部的疾病,肿瘤、感染等;②妊娠期、哺乳期或不同意在试验期间采用有效
避孕措施的妇女;③基线前4周内,关节腔内注射或其他途径注射过皮质激素者。另以本院健康体检者20名为健康对照组,其中男性7名,女性13名,年龄22~67岁,平均(45±10)岁。
1.2 分组治疗:将44例RA患者按照随机化产生的编号入组,分为rhCTLA-4Ig组
和安慰剂组,每组22例。用药期间,安慰剂与rhCTLA-4Ig采用相同的包装,保持相同的剂型和外观。rhCTLA-4Ig由上海中信国健提供的临床Ⅱ期试验药品(批号为2006L01306),应用方法为入组后第0、15、29、57、85天静脉给药1次,剂量为10mg/kg,共5次,安慰剂为中信国健药业提供的Ⅱ期临床试验安慰剂针。并且分别于第2、4、8、12周随访1次,第14周和第24走进行电话随访2次。该研究过程遵循我国人体试验委员会制定的伦理学标准,并经我院理论委员会批准,所有患者遵循自愿原则参加中信国健的Ⅱ期临床试验并签署知情同意书。
1.3 临床指标的观察及检测:检测RA患者活动度相关指标:ESR、CRP、类风湿因子(RF),统计RA患者肿胀关节数、压痛关节数、晨僵时间。采用欧盟CAS评分观察疗效,同时应用ACR20、50、70标准进行疗效评定,患者的功能状况应用健康状况问卷(HAQ)评估。同时检测血常规、尿常规、肝功能、肾功能等临床指标,并随访观察药物相关的不良反应。
1.4 血清TNF- 和CX3CL1水平的检测:健康对照组及所有RA患者用药及用药12周后采静脉血,3000r/min离心5min,分离血清,-80℃冰箱保存,同批检测。一次冻融后进行TNF- 和CX3CL1水平的检测,试剂盒和标准品由美国R﹠G公司提供,采用双抗体夹心酶免疫吸附试验(ELISA)法,具体步骤严格按说明书操作。
1.5 统计学处理:所有数据均使用SPSS11.5软件系统处理,计量资料用 ±s表示,组间比较采用t检验,计数资料采用 检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 RA患者rhCTKA-4Ig治疗组及安慰剂组一般资料的比较:本中心临床试验共入组RA患者44例,rhCTKA-4Ig治疗组及安慰剂组患者的一般资料基线情况差异无统计学意义(P>0.05)。
2.2 RA患者rhCTKA-4Ig治疗组及安慰剂组用药前后临床相关的比较:rhCTKA-4Ig治疗组及安慰剂组用药前各项临床相关指标组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。RA患者rhCTKA-4Ig治疗组用药12周后,肿胀关节数额、压痛关节数、晨僵时间、HAQ评分、患者及医生视觉模拟评分(VAS)均较治疗前明显下降,与治疗前比较差异有统计学意义(P均<0.01),而且患者的ESA、CRP、DAS28评分等疾病活动指标与治疗前相比也明显下降,差异有统计学意义(P均<0.01),但是治疗前后RF水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。同时安慰剂组经12周治疗后上述各项观察指标与用药前比较差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.3 rhCTKA-4Ig治疗12周后RA患者ACR评分:rhCTKA-4Ig治疗12周后95% RA患者(20/21)达到ACR20,76%RA患者(16/21)达到ACR50,19%RA患者(4/21)达到ACR70,而安慰剂组无一例达到ACR的缓解指标。2组ACR20、ACR50缓解率比较差异有统计学意义( =39.17,26,69,P均<0.01),2组ACR70缓解率比较差异均无统计学意义( =2.64,26,69,P>0.05)。
2.4 RA患者治疗前后血清TNF- 、CX3CL1水平的比较:用药前RA患者血清TNF- 、CX3CL1水平与健康对照组比较差异有统计学意义(P均<0.01),但是治疗组与安慰剂组用药前血清TNF- 、CX3CL1水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。经过12周治疗后,rhCTKA-4Ig治疗组TNF- 、CX3CL1水平明显下降,与治疗前比较差异有统计学意义(P均<0.01),而且与安慰剂组差异有统计学意义(P <0.05),.安慰剂血清TNF- 、CX3CL1水平用药前后比较差异无统计学意义(P>0.05)。
2.5 安全性初步评价:rhCTKA-4Ig治疗组22例患者中有1例在第一次静脉滴注治疗过程中出现
荨麻疹样皮疹。推出临床试验,1例患者存在皮肤瘙痒,经对症处理后缓解并完成实验;其余20例患者在治疗12周期间无不良反应发生,对本品耐受性好,无新发结核和恶性肿瘤,而且试验过程呈监测血常规、尿常规及肝功能、肾功能等指标差异无统计学意义。另外我们队患者用药期间及用药6个月后进行电话随访,无一例重症感染发生。
3 讨论
目前研究认为多种因数促使T细胞的活化的RA发病的始动环节,T细胞活化通过细胞-细胞间的黏附,致使多种免疫细胞活化,TNF- 、白细胞介素(IL)-1等多种细胞因子分泌增多,导致关节滑膜炎症、血管翳形成、软骨及骨侵蚀的发生。T细胞的活化需要双信号系统,而CD28和CDLA-4是通过这种活化性和抑制性共同活化信号调节T细胞免疫应答的关键受体,研究发现在未治疗的RA患者外周血CTLA-4的表达很低,rhCTKA-4Ig是由人CTLA-4细胞外部分和人IgGFc段形成的融合蛋白,能竞争性地与抗原递呈细胞表面CD80/CD86结合,防止这些分子与T细胞的表面的CD28结合,选择性地调节该刺激通路,阻断T细胞活化和依赖T细胞的B细胞功能。在动物实验中发现,CTLA-4Ig可以使IL-2、IL-4和IL-10的分泌和合成减少,同时它对免疫的早期和晚期反应都有抑制。本研究上海中信国健提供的,rhCTKA-4Ig用于RA治疗进行Ⅱ期临床观察,发现RA患者经过12周治疗后,患者的肿胀关节数、压痛关节数明显减少,晨僵时间缩短,HAQ评分等临床症状明显改善,而且ESR、CRP等疾病活动性指标较治疗前明显下降。21例完成试验的RA患者中20例达到ACR20,16例达到ACR50,与安慰剂组比较差异有统计学意义,说明rhCTKA-4Ig临床疗效确实,而且与文献的观察结果相近。RA患者临床症状的改善与rhCTKA-4Ig抑制T细胞活化,阻断T细胞与单核巨噬细胞的相互作用,使前列腺素、白三烯等致炎细胞因子的分泌减少有关吧,进而使患者关节肿胀及疼痛症状明显缓解,活动能力得到提高。
国内外研究已经证实,TNF- 是T细胞活化后产生,参与RA的炎症反应、关节滑膜及划破坏的关键细胞因子。因此,阻断T细胞活化的协调刺激通路,才能抑制T细胞活化,使TNF- 、IL-1等细胞因子分泌减少。我们应用rhCTKA-4Ig治疗RA是为了使rhCTKA-4Ig与T细胞表面的B7竞争结合,抑制B7与CD28的结合,抑制T细胞的活化,使TNF- 、IL-1等细胞因子分泌减少。我们的研究证实了这一结果,治疗前RA患者血清TNF- 明显高于健康对照组,而治疗后TNF- 水平较治疗前明显下降。此外,RA患者发病机制中T细胞活化后通过T-B细胞的相互作用导致B细胞的活化,导致RF分泌增多,RF滴度升高是RA预后不良因素之一,因此我们期望通过rhCTKA-4Ig治疗使B细胞活化受抑制,RF滴度下降,但是我们的研究没有得到预期结果,这说明B细胞活化导致RF增多不单单由T细胞活化所致,可能受多方面机制调控和影响,需要更多的研究区证实。
研究发现,不仅TNF- 、IL-1等T细胞相关活化因子分泌增多在RA发病机制中发挥着重要的作用,而且RA患者体内多种异常升高的趋化因子促使T细胞、中性粒细胞等炎症细胞向关节腔趋化,有人是导致关节关节滑膜及骨破坏的主要原因之一,特别是近两年研发现,趋化因子CX3CL1在RA患者体内明显升高,并通过促进滑膜成纤维细胞增值、基质金属蛋白酶的合成及增强破骨细胞活化导致RA关节软骨及骨的侵蚀和破坏,而且CX3CL1还通过募集单核细胞、自然杀伤细胞与内皮细胞的黏附,并加速血小板的活化,参与RA血管炎的发生,在RA发生发展过程中起着重要的作用。本研究也发现RA患者体内存在异常升高的CX3CL1,RA患者经过rhCTKA-4Ig治疗后血清CX3CL1血清水平明显下降。说明rhCTKA-4Ig不仅能阻断协调刺激通路抑制T细胞的活化,减少TNF- 、IL-1等细胞因子的产生,而且使趋化因子CX3CL1是生成减少,这可能与TNF- 和多种趋化因子的产生促进有关。因此,应用rhCTKA-4Ig治疗RA,一方面抑制与T细胞活化相关的细胞因子产生,另一方面减少了以CX3CL1为代表的趋化因子的分泌,使滑膜成纤维样细胞、破骨细胞、内皮细胞的活化明显受抑制,使基质金属蛋白酶释放减少,减轻关节滑膜増生及骨质破坏,明显控制RA病情。此外已经有研究认为rhCTKA-4Ig主要抑制已经活化的T细胞,对正常的T细胞无明显的抑制作用,所有对RA患者的正常免疫功能无影响,不会明显增加感染的机会。我们对患者用药期间及用药6个月后进行电话随访,无一例重症感染发生,也证实了这一点。本研究只有一例患者因出现皮肤荨麻皮疹推出临床试验,可能与rhCTKA-4Ig未异体蛋白导致过敏有关,其他不良反应少见,总体耐受性良好。
综上所述,rhCTKA-4Ig抗体融合蛋白为RA的临床治疗提供了新的靶向,通过抑制T细胞的活化阻断TNF- 和CX3CL1的表达,明显改善关节功能及疾病预后。