类风湿关节炎(rheumatiod arthritis,RA)的发病机制尚不明显,目前较为认可的机制是机体内T细胞亚群和B细胞的失衡等免疫系统紊乱。近来有学者发现机体内存在着一群新型的不同于辅助性T细胞(TH)1、TH2、TH17及调节性T细胞等的CD T细胞亚群,由于该细胞亚群主要分泌白细胞就(IL)-9,所以将其命名为TH9,最近有学者提出该细胞可能与自身免疫病的发病机制有关。目前外周血中CD CD IL- 标记的TH9与自身免疫病的发病机制研究较少,本实验旨在初步探讨TH9细胞在RA发病中可能的作用。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选择2011年1月至7月在安微医科大学第一附属医院住院的36例RA患者,诊断均符合美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟(ACR/EULAR)2009年RA分类诊断标准的患者,其中男性7例,女性29例,年龄26~76岁,平均(56±14)岁,病程6个月至38年,平均(9±8)年。并收集患者的关节压痛数、关节肿胀数、有无晨僵、关节畸形、功能障碍、血管炎、双手X线平片、红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体等临床指标数据。根据EULAR推荐的RA疾病活动指数(DAS)28评分将RA患者分为病情重度活动组(DAS28≥5.1)22例和病情中度活动组(3.2≤DAS28<5.1)14 例;根据双手X线定义,≥3级为严重骨质破坏,≤2级为无或轻度骨质破坏,其中严重骨质破坏23例,无或轻度骨质破坏13例;心电图异常包括窦性心动过速,窦性心动过缓,ST-T段压低,T波异常,其中心电图异常的16例,无异常20例;有类风湿结节、皮肤血管炎样皮疹以及肌电图提示有神经肌肉传导异常则定义为有血管炎,其中有血管炎表现的6例,无血管炎表现的30例。健康对照组22例,来自门诊体检的健康自愿者,其中男性7例,女性15例,年龄26~70岁,平均(50±13)岁,2组在年龄及性别上差异无统计学意义(P>0.05)。本研究符合中国人体试验委员会所制定的伦理学标准并得到了该委员会的批准,并取得了试验对象的知情同意。
1.2 试剂
异硫氰酸荧光素(FITC)-抗人CD8抗体、藻红蛋白(PE)-抗人IL-9、别藻蓝蛋白(APC)-抗人CD3抗体、澡红蛋白标记的鼠IgG2b同型对照购自美国eBio-science,佛波酯(PMA)、离子霉素、莫能菌数(Moen-sin)购自瑞士Alexis公司,RPMI 1640培养基购自Hyclone公司,固定剂、破膜剂购自美国Beakman-coulter公司,淋巴细胞分离液购自天津TBD公司,磷酸盐缓冲液(PBS)购自欧蒙试剂公司。
1.3 仪器
HF90型二氧化碳孵育箱购自上海力申科学仪器有限公司,低速离心机系科大创新中佳公司,型号为KDL-40,流式细胞仪型号为FACScalibur,系美国BD公司产品。
1.4 方法
1.4.1 标本收集:早晨空腹留取各受试对象肝素钠抗凝静脉血4ml,离心留取1ml血浆,置于-80°冰箱中冻存。余下血细胞以密度梯度法用淋巴细胞分离液出外周血单个核细胞(PBMCs),用PBS洗涤细胞两次。
1.4.2 细胞染色及流式细胞仪发现:显微镜下观察细胞形态及计数,并用1640培养基调整细胞浓度为5× /ml。依次加入佛波酯、离子霉素、莫能菌数,使其终浓度分别为50,1,0.5µg/ml,于 孵育箱中孵育6h后取出,以PBS洗涤2次。将上述培养好的标本分别进行荧光标记抗体的表面染色,每1× /ml细胞中分别加入抗IL-9澡红蛋白10µl,4℃避光孵育25min,PBS洗涤后,1500r/min离心5min,弃上清,重复洗1遍,加入100µl 1%的多聚甲醛固定剂处理后上机检测。我们定义CD CD IL- T细胞为外周血Th9细胞。
1.4.3 胞外细胞因子检测:IL-9的检测方法严格按照酶联免疫吸附试验(ELISA)说明书操作。
1.5 统计学处理
采用SPSS17.0软件包进行系统分析,对于正态分布及接近正态分布的剂量资料用 ±s表示,组间均数的比较采用t检验,相关性分析采用Spearman秩和相关分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 RA患者外周血中Th9及IL-9的比较:RA患者外周血中TH9表达率及IL-9水平明显高于健康对照组,RA患者重度活动组的TH9比例及IL-9水平明显高于中度活动组,RA患者组的Th9比例及IL-9水平均明显高于健康对照组(P<0.05)。
2.2 RA患者外周血中Th9与各临床指标的相关性:Th9的表达水平与患者的关节压痛数、关节肿胀数、ESR、CRP、DAS28及RF呈正相关,亦与血清中IL-9水平呈正相关(P均<0.05);而与病程、晨僵、抗CCP抗体、心电图异常、骨质破坏程度以及有无血管炎无相关性(<0.05)。
2.3 RA患者血浆中的IL-9与各临床指标的相关性:RA患者IL-9的水平与患者的关节压痛数、关节肿胀数、ESR及DAS28呈正相关(P <0.05);而与病程、晨僵、CRP、抗CCP抗体、RF、心电图异常、骨质破坏程度以及有无血管炎无相关性(<0.05)。
3 讨论
过去一直认为IL-9属于Th2类细胞因子,可作用于多种炎症细胞和组织细胞中,在对抗寄生虫感染和诱导过敏性疾病,尤其是在过敏性哮喘中发挥着重要的作用。2008年Veldhoen和Dardalhon几乎同时发现转化生长因子(TGF)- 联合IL-4刺激CD 初始T细胞可诱导出一类新型效应性独立的T细胞亚群,可特异性分泌大量IL-9,命名为“Th9”细胞,系CD T细胞家族一新成员,并通过体外实验证明TGF- 能够诱导已经分化为Th2的细胞重新分化为Th9。进一步功能研究发现,Th9细胞在共刺激分子的作用下具有比初始T细胞更强的增值能力,但是并不具备免疫抑制功能,体内功能实验提示了该细胞亚群与自身免疫病关系密切,主要作用是使炎症细胞的数量上升并分泌一些炎症介质,促进炎症的发生,最新研究认为其特异的转录因子是PU-1。密切Th9与自身免疫病的确切发病机制还尚不清楚,本研究通过检测RA患者外周血中Th9细胞及相关细胞因子IL-9的变化特点,分析该细胞与临床指标及疾病活动的关联性,并探讨了该细胞在RA疾病发展中可能的作用。
本研究发现,RA患者外周血Th9表达较健康对组组明显增多,并且随着病情活动度的增强,Th9的表达率越高,故推测Th9亦可促进RA患者体内炎症的发生,该细胞的增多可能是RA反的重要原因。本研究同时显示与Th9关系最密切的细胞因子IL-9的水平均随着疾病活动度的增强而升高,同时RA患者血清中的该细胞因子水平均明显高于健康对照组。Xing等研究过敏性哮喘患者体内的Th9表达率及IL-9水平时发现患者体内的含量明显高于健康对照组,提出该细胞可以作用于炎症细胞和组织细胞,使淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞的量增多,提高了IgE分泌,促进了炎症细胞分泌一些细胞因子参与炎症,并推测该细胞在过敏性哮喘等各种自身免疫病发生、发展的过程中起着主要的作用,这一观点与Li等的看法一致。Zhou等研究
多发性硬化的动物模型,发现其体内的Th9及IL-9含量亦显著升高,并且用IL-9体内刺激星形胶质细胞可以引起Th17在局部的积聚,证实Th9细胞不但不会抑制效应性T细胞的增值,而且还有促进炎症发生的作用,但是与多发性硬化发病的免疫学机制尚不清楚。目前国内外关于该细胞研究的热点是在变态反应性疾病、
肿瘤以及多多发性硬化等免疫性疾病方面,而以RA的临床相关性研究尚未见报道。
本研究亦发现Th9的表达水平与患者的DAS28评分、关节肿胀数、关节压痛数、ERS、CRP等炎症指标,及RF这一非特异性的抗体呈正相关,说明Th9细胞的过渡表达可能导致病情活动,进一步证实了Th9可以促进体内炎症发生这一功能。而Th9表达率与病程无明显相关性,说明Th9参与RA整个病程,贯穿疾病始终。从上述资料可以看出IL-9与DAS28评分、关节肿胀数、关节压痛数、ESR等呈正相关,从而更加证明了Th9大量分泌IL-9,促进体内炎症的发生,以至于诱发自身免疫病的发生。Jutel和Akdis发现在自身免疫病中Th9可诱发组织炎症恰好可以解释本研究中Th9及IL-9均与关节压痛数、关节肿胀数呈正相关。文献[3-4]发现IL-9的表达与促炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)- 、IL-1、IL-17、干扰素- 有一定的关联,这些细胞因子与IL-9共同介导炎症反应参与某些自身免疫病的病理过程。在RA患者中,血清IL-9伴随着细胞因子TNF- 、IL-1、IL-17、干扰素- 的产生其水平亦上升,表明IL-9与这些促炎症细胞因子共同参与了RA的病理过程,推测IL-9是调节自身免疫病的炎症的一种治疗靶向。Ciprandi等发现哮喘患者体内IL-9的水平与其症状严重程度相关,故推测IL-9的水平可作为自身免疫病活动的标志,与本研究得出的结果一致。目前国内外尚无关于该细胞与自身免疫病如RA病情活动度相关性研究。
综上所述,RA患者外周血中Th9表达率高于健康对照组,而RA中该细胞的表达率与病情活动度呈正相关,同时高Th9的表达率可表现出更多的关节肿胀、关节压痛、关节畸形等临床表现,更加提示了该群细胞的过渡表达也可能参与了RA的起病。而Th9紧密相关的细胞因子IL-9其水平与疾病活动度一致,并与疾病相关炎症的指标呈正相关,说明该细胞参与了RA发病机制及疾病活动。