心性猝死(sudden cardiac death,SCD)是心室肥厚及早期心力衰竭患者的主要死因[1,2]。卡维地洛(carvedilol,CVD)是第三代β受体阻滞剂的代表,COPERNICUS[3]、COMET[4]等临床循证医学试验证实CVD能显着降低上述患者预后,有关CVD上述效应确切机制的探讨已成为心脏学界热点之一。国内外研究[5,6]显示:跨壁复极离散度(transmural dispersion of repolarization,TDR)显着增大基础上的跨室壁折返是引起多形性室速(polymorphic ventricular tachycardia,PMVT)、尖端扭转性室速(torsade de pointes,Tdp),进而导致SCD的主要机制。本组先前研究[7]显示:CVD长期干预能显着降低TDR和室性心律失常率。但单细胞研究表明[8]:不同浓度的CVD能够直接影响心肌细胞的跨膜离子流强度,进而改变心肌细胞复极过程以及动作电位特征,这种效应具有瞬时性、浓度依赖性。该效应是否与CVD预防SCD效果相关尚无报道。本研究以CVD长期灌胃的稳定期血药浓度为基准,探讨CVD瞬时效应对于兔肥厚左心室跨壁复极离散度及心律失常的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物 选择10~12周龄健康大白兔,体重1 900~2 100 kg,由西安交通大学动物实验中心提供。
1.1.2 仪器 多普勒超声心动仪(HP Sonos 2500,USA);DT-100型电子天平;MEZ-8301型、MEZ-7101型微电极放大器、SEN-7103型电刺激仪、SS-102J型刺激隔离器、VC-11双线记忆示波器;手动微电极操纵器(带千分微调尺)3台;自制有机玻璃恒温灌流肌浴槽;CS501型超级恒温器;LDB-H型电子蠕动泵;玻璃微电极毛胚;PB-2型微电极拉制仪; PowerLab/8sp实验数据记录分析系统。
1.1.3 试剂 3%戊巴比妥钠;台氏液(Tyrode’s solution)构成:NaCl 129.0 mmol/L,KCl 4.0 mmol/L,NaH2PO4 0.9 mmol/L,NaHCO3 20.0 mmol/L,CaCl2 1.8 mmol/L,MgSO4 0.5 mmol/L,葡萄糖5.5 mmol/L,胰岛素1 u/L;心脏停搏液:KCl浓度为24 mmol/L的台氏液。卡维地洛标准品由上海罗氏药业集团提供。甲醇:色谱纯,批号980711,天津市康科德科技有限公司生产;乙腈:购自上海勤工化学厂。
1.2 方法
1.2.1 左心室肥厚兔模型的制备及CVD灌胃 采用肾上腹主动脉部分结扎法制做兔左心室高后负荷模型[9]。腹主动脉结扎术后48 h,开始对兔进行CVD 1 mg/kg,每日2次灌胃,共持续10周。
1.2.2 CVD灌胃动物稳定期血药浓度测定 采用高效液相色谱分析法;以最后一次给药后3~6 h内的CVD血药浓度为稳定期血药浓度。具体步骤:(1)耳缘静脉采血4 ml,注入枸橼酸钠抗凝管中。4 ℃条件下,4000 r/min离心10 min,吸取上清液-20 ℃冻存。(2)标准空白血清制备:取正常成年兔全血100 ml,在4 ℃条件下,经低温高速离心后取血清部分冻存。(3)血样处理:将1 ml血样加入0.1 ml 0.1N的NaOH溶液中,再加入0.9 ml饱和NaCl溶液。用5 ml乙醚萃取。于-30 ℃冷冻后,倒出上层的有机相,加入250 μl磷酸盐溶液(50 mmol,pH 2.0)进行反萃。取50 μl水层进样。(4)标准曲线制作:在标准空白血清内加入CVD标准品,配制成浓度为25、50、100、250、500、1000、2000 ng/ml的一系列血清样品。按照样品处理法处理后进行测定。根据测定结果拟合加权回归方程,检测波长240 nm。(5)精密度检测和回收率试验:精密度检测采用日内变异;取空白血清,加入定量的CVD标准品,配制50、250、1000 ng/ml浓度的卡维地洛溶液,在(285±1)nm处测定吸收度,计算回收率。(6)样品浓度测定:将1 ml待测血清加入0.1 ml 0.1N的NaOH溶液中,再加入0.9 ml饱和NaCl溶液。用5 ml乙醚萃取。于-30 ℃冷冻后,倒出上层的有机相,加入250 μl磷酸盐溶液(50 mmol,pH 2.0)进行反萃。精密测量水层样50 μl注入色谱仪,记录色谱图,量取峰值面积。以稳定期CVD浓度(HPLC法测定)为基准,在DMSO助溶下,配制含等浓度CVD的台式液。记录普通台式液、CVD台式液灌注(各持续1 h)对肥厚心肌标本动作电位和TDR的影响。
1.2.3 经冠状小动脉灌注的兔左心室楔形组织块的制作和灌流 参照文献[10]。肝素抗凝及戊巴比妥钠充分麻醉基础上,迅速开胸取出心脏放入4 ℃高钾台氏液中,使心脏停搏。以自制冠脉灌注管经左冠状动脉开口插入冠状动脉左室支,予以台氏液灌注,并结扎固定冠脉灌注管。分离出以冠脉血管为中心轴、长约10~20 mm、宽约5~10 mm厚约3~4 mm心室肌楔形组织块,在恒温肌浴槽内固定。将冠脉灌注管连接蠕动泵行持续台氏液灌流,保证灌注压维持在20~30 mm Hg。在浴槽内及灌流的台氏液中持续充混合气(95%O2与5%CO2),使pH值维持在7.35~7.45。温度恒定于37 ℃。将自制双极同心银电极固定于组织块的心内膜面,给予基础周长(basic cycle length,BCL)1 s的电刺激使组织块平衡1 h。保持心电图电极和心内、外膜浮置玻璃微电极置于同一跨壁轴线上。
1.2.4 对比指标 对比台式液、稳定期CVD血药浓度的台式液分别灌注1 h时肥厚左心室标本APD、TDR以及QT间期变化;对比台式液及CVD台式液灌注过程中心律失常发生率的变化。动作电位时程(APD)以90%复极时的动作电位时程(APD90)计算;同一部位内、外层心肌中APD差值(APDmax-APDmin)为跨壁复极离散度,本文以APD90离散度(APD90max-APD90min)作为TDR评价指标。
1.3 统计学方法 所有数值均采用(x±s)表示。采用SPSS 11.0软件进行分析,两组之间比较采用独立样本t检验,率比较采用χ2检验,P<0.05为差异具有显着性。表1 普通台式液及0.1 μmol/L CVD台式液灌注时APD、TDR及QT间期比较注:同一肥厚心肌标本在0.1 μmol/L CVD台式液与台式液灌注1 h的APD90、TDR及QT间期相比较,各指标之间差异无显着性(P>0.05)
2 结果
2.1 卡维地洛灌胃组兔稳定期血药浓度测定 测定来自10只卡维地洛灌胃组兔的血样标本,每只动物分离出3份,测定后取平均值。以上结果显示灌胃组兔血液中卡维地洛浓度为(0.106±0.035)μmol/L,本研究取0.1 μmol/L为稳定期血药浓度。
2.2 0.1 μmol/L CVD台式液灌注对于结扎组兔心肌标本APD、TDR的影响 在台式液、0.1 μmol/L CVD台式液灌注过程中,同一组肥厚左心室标本APD90和TDR的无显着变化;室性心律失常发生率无显着变化(P>0.05)。
2.3 0.1 μmol/L CVD台式液灌注对于结扎组标本室性心律失常的影响 台式液灌注过程中,8/9例出现2或3相EAD,7/9例触发R-on-T早搏,5/9例出现自发性PMVT或Tdp,三者发生率分别为88.9%、77.8%、55.6%;0.1 μmol/L CVD台式液灌注过程中,8/9例发生EAD,7/9例出现R-on-T早搏,6/9例触发PMVT或Tdp,三者发生率分别为88.9%、77.8%、66.7%。两组标本的室性心律失常发生率之间差异无统计学意义(P>0.05)。
3 讨论
与其他β1受体阻滞剂不同,CVD能通过长期效应和瞬时效应两种方式影响心室肌细胞的电生理特性,长期效应指长期给药对于心脏电重塑的改善,是神经内分泌拮抗、减轻心脏负荷、降低心肌耗氧、抗氧化应激等的综合体现。瞬时效应指CVD能与多种心肌细胞离子通道的膜外位点瞬间形成低亲和力结合,发挥通道阻滞作用。不同浓度的CVD能够直接影响单个心肌细胞的多种跨膜离子流强度,包括复极相关电流Ikr、Ito、Ica-L和Iks,半数抑制浓度IC50分别为0.35、3.34、3.59和12.54 μmol/L[8]。该效应具有以下特点:(1)靶通道具有多样性和非特异性;(2)靶通道的类型、特定跨膜离子流抑制程度均和CVD浓度密切相关,而膜电压无关;(3)离子通道阻滞效应发生迅速,如CVD组织HERG基因编码产物Ikr通道仅需2 min,起效远快于其特异性通道阻断剂Dofetilide[11];(4)结合不紧密,能被灌流液部分洗脱。
在连续服用CVD的个体中,上述两种效应显然同时存在。明确CVD的瞬时效应对于肥厚左室心肌动作电位、跨壁复极离散度以及室性心律失常的影响,有利于加深对于CVD药理机制的全面、深入理解,且对于CVD用药方式具有重要指导意义。
CVD在口服给药1~2 h达到血浆峰药浓度,血浆清除半衰期2~8 h,体内排除半衰期7~10 h。我们将采血时间控制在灌胃给药后3~6 h,于血药浓度峰值之后和第一个半衰期到来之前,这时的血药浓度代表了整个干预过程中的稳定浓度值,经HPLC法测定近似于0.1 μmol/L。
与普通台式液相比,0.1 μmol/L CVD灌注下肥厚心室肌电生理模型内外膜动作电位、跨壁复极离散度及QT间期无显着差异;在相同灌注时间内,后除极、R-on-T室性早搏以及PMVT/Tdp的发生率差异不明显。结合长期干预试验[7]结果,笔者认为:CVD对离子流阻滞的瞬时效应对肥厚心室心律失常的发生并无影响,究其原因可能与稳定期血药浓度(0.1 μmol/L)显着低于其复极电流相关通道有效阻滞浓度(0.35~12.54 μmol/L)[8]有关;同时也表明CVD预防SCD、改善预后作用主要是通过其长期效应来实现的。因此对于左心室肥厚以及心力衰竭患者,尽早、长期、全程应用卡维地洛是改善预后的唯一途径。(参考来源:卡维地洛瞬时效应对兔肥厚左心室跨壁复极离散度及心律失常影响,崔长琮,中华现代内科学杂志2007年第4卷第11期 )