【摘要】 目的 研究白癜风黑素细胞超微结果和小眼畸形相关转录因子(MITF)及其转录调控的酪氨酸酶相关蛋白(TRP)与白癜风临床类型与病程的相关性。方法 选择不同病程的寻常型白癜风(VV)12例和节段型白癜风(SV)8例,分别取白斑区、白斑边缘正常肤色区和远离白斑正常肤色区的表皮片,经组织学确定其表皮的完整性。透射电镜观察10例患者(VV 6例,SV 4例)不同区表皮黑素细胞的超微结构特点。对所有20例远离白斑正常肤色区的表皮片黑素细胞进行培养,应用免疫印迹方法检测MITF及其转录调控的酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TYPR1)和酪氨酸酶相关蛋白2(TYRP2)的表达水平。结果 白癜风表皮黑素细胞超微结构病理改变:10例中7例白斑区表皮内未见黑素细胞,1例短病程和2例长病程VV分别可见少量黑素体显著减少或缺失的黑素细胞;白斑边缘正常肤色区,6例VV中,3例病程小于15个月者可见黑素细胞超微结构异常,而4例SV中仅1例异常;远离白斑正常肤色区,10例黑素细胞超微结构均正常。白癜风表皮黑素细胞MITF及其转录调控TRP的表达:VV的MITF表达下调与TYR、TYRP1、TYRP2的表达下调一致;SV存在MITF显著表达下调,而TYR、TYRP1、TYRP2几均正常表达。 结论 VV和SV可能存在不同的表皮黑素细胞超微结构病理改变和MITF转录调控机制。
【关键词】 白癜风;黑素细胞;黑色素小体;小眼畸形相关转录因子
白癜风是一种难治性皮肤色素脱失性疾病,根据临床特征分为寻常型白癜风(VV)和节段型白癜风(SV)。目前认为VV的发病与免疫或氧化应激造成表皮黑素细胞损伤有关,而SV则可能与遗传缺陷有关,研究VV和SV不同的黑素细胞缺陷机制,对于选择相应的治疗方法具有重要的指导意义。人类皮肤黑素生成过程中,有酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1)和酪氨酸酶相关蛋白2(TYRP2)等构成的酪氨酸酶相关蛋白(TYR)发挥着核心作用,并受作为黑素细胞标志的小眼畸形相关转录因子(MITF)的转录调控。本研究首先对具有不同病程的VV和SV患者的白斑区、白斑边缘区以及远离白斑的正常肤色区皮肤进行超微结构研究,并对来源于远离白斑的正常肤色区的表皮片黑素细胞进行培养,分析MITF及其转录调控的TYR、TYRP1和TYRP2的表达。
病例与方法
一、 病例
1. 病例与标本:选择我院白癜风专病门诊确诊病例20例,男9例,女11例,年龄16~35岁,病程平均为26个月(3~300个月),其中VV12例,SV 8例。所有病例均在白斑区、白斑边缘正常肤色区、远离白斑的腹部或臀部的正常肤色区进行负压吸疱各2~6枚,吸疱压力约为40kPa,吸疱时间40~100min均为完全起疱。所有皮片均行常规组织学检查,对远离白斑正常肤色区表皮片进行黑素细胞培养,选择其中6例VV和4例SV行透射电镜检查。另取我科表皮囊肿手术切除的4例正常人皮肤组织作为对照。本研究获得我院伦理委员会批准,同时所有患者均知情同意。
2.试剂:F12基础培养基、胎牛血清、谷氨酰胺、庆大霉素、0.25%胰酶、0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)、0.05%胰酶-EDTA、D-Hanks液、基因素均购自美国Gibco公司,人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自美国Pepro—Tech公司,MITF(Ab12039)、TYR(Ab52493)、TYRP1(Ab3312)和TYRP2(Ab74073)均为英国Abcom公司产品,3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、层黏连蛋白和Ⅳ型胶原抗体均为美国Santa Cruz公司产品。
二、方法
1.表皮完整性的确定:所有皮片均经苏木素-伊红(HE)染色,针对层黏连蛋白和Ⅳ型胶原的免疫组化检查,确定表皮的完整性。
2.透射电镜观察:观察10例(VV 6例,SV 4例)不同区表皮黑素细胞的超微结果特点。表皮片以3%戊二醛固定,按透视电镜常规制作超薄切片,于电镜下观察、拍照。
3.表皮片黑素细胞培养:所有20例远离白斑正常肤色区的表皮片黑素细胞进行培养。取远离白斑正常肤色区表皮片4枚浸入无菌D-Hanks液中并漂洗2次,分别以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA于
4.免疫印迹:按照分子克隆操作手册,常规进行细胞总蛋白提取并定量、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),免疫印迹(湿转),免疫显色。各抗体工作浓度:MITF、TYR、TYRP1均为1:500,TYRP2为1:200,GAPDH和二抗均为1:5000。
5.统计分析:应用Band Scanner生物医学软件,记录并分析MITF、TYR、TYRP1、TYRP2与内参照GAPDH的灰度值比。应用F检验进行方差齐性检验,根据方差齐性结果,选择两组间t检验或t’检验,比较MITF、TYR、TYRP1、TYRP2的蛋白表达差异。以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、白癜风表皮黑素细胞超微结构的特点
①正常肤色区:和正常人所见相同,均可见正常细胞器和黑素体结构,为较多呈卵圆形的黑素化较完全的Ⅲ、Ⅳ期黑素体及少量不完全黑素化的Ⅰ期和Ⅱ期黑素体。②白斑边缘区:4例SV中仅1例存在黑素细胞内质网肿胀,核周空泡形成;而6例VV中,3例病程短于15个月者可见正常黑素体形成障碍和黑素体聚集现象,粗面内质网肿胀,黑素细胞核周围水肿或形成空泡结构。③白斑区:7例黑素细胞完全消失,1例病程为3个月的VV白斑区中残留的黑素细胞可见明显的黑素体减少和和核周空泡形成,2例病程超过10年的VV可见少量黑素体结构完全消失的黑素细胞。
二、白癜风黑素细胞MITF及其转录调控分子TYR、TYRP1、TYRP2的表达情况
12例VV和8例SV表皮的黑素细胞MITF、TYR、TYRP1、TYRP2的相对表达情况见表1.
表1 黑素细胞MITF、TYR、TYRP1、TYRP2的相对表达情况(
组别 |
例数 |
MITF |
TYP |
TYRP1 |
TYRP2 |
白癜风组 |
|
|
|
|
|
寻常组 |
12 |
0.82±0.17 |
0.80±0.19 |
0.61±0.17 |
0.34±0.16a |
节段组 |
8 |
0.59±0.26a |
0.86±0.10 |
0.72±0.06 |
0.42±0.15 |
正常对照组 |
4 |
0.92±0.29 |
0.88±0.04 |
0.71±0.03 |
0.50±0.02 |
与正常对照组比较,VV组TYRP2的表达下调,SV组的MITF表达下调。12例VV中,2例MITF、TYR、TYRP1、TYRP2均同时有表达下调,另外3例仅有TYRP2表达下调;8例SV中,5例存在MITF表达下调,而TYR和TYRP1均表达正常,仅1例存在TYRP2表达下调不一致,提示SV的黑素生成障碍可能不依赖于MITF的转录调控。
讨论
黑素体是黑素合成的惟一场所,是一种类似于溶酶体的细胞器,包括酶成分和结构成分,黑素体外形结构与形成黑素的类型相关,其中优黑素呈卵圆形,含纤维性基质,跟证据黑素化程度分为Ⅰ~Ⅳ期。黑素细胞的细胞器粗面内织网(RER)、转运高尔基体网络(TGN)、TRP是黑素(体)形成的物质基础。
既往对白癜风黑素细胞超微结构观察发现:白癜风白斑区表皮内几无黑素细胞,但是有作者发现部分白癜风皮损中仍然残留黑素细胞,只是其不具有合成黑素的功能;活动期白癜风多见的白斑周围正常肤色区存在黑素细胞超微结构病理的改变,也可见于稳定期白癜风的白斑周围正常肤色区,主要表现为黑素体形成与转运障碍,以及与黑素形成密切相关的粗面内织网和高尔基体的结构异常;体外培养的白癜风正常肤色区的黑素细胞同样存在类似的超微结构病理改变。我们的研究表明:白癜风白斑区表皮内无黑素细胞,但长病程者仍存在少量无黑素生成活性的黑素细胞;白斑周围正常肤色区的黑素细胞超微结构病理改变与病程长短和白癜风临床类型密切相关:黑素细胞超微结构在SV和长病程(稳定期)VV正常,而短病程(进展期)VV异常;远离白斑区的正常肤色区,无论其临床类型和病程长短,黑素细胞超微结构及黑溯溪生成功能均正常。
人类皮肤黑素生成由超过90余个位点、150余个等位基因、200多种分子共同组成了有序、立体的调控网络,其中,TYR为黑素生成,为优黑素生成的速度调节器。作为黑素细胞的标志,MITF构筑的转录调控网络在黑素细胞的发育、分化和功能等方面发挥着重要的作用。MITF基因突变可导致人类Waardenburg综合征2型和小鼠白癜风,但有学者证实,MITF基因突变与人类白癜风无关。由于患有b-HLH-ZIP结构的MITF转录调控与黑素生成密切相关的TYR、TYRP1和TYRP2等重要分子,因此,MITF功能抑制与白癜风相关。本研究通过远离白斑的正常肤色区表皮黑素细胞培养后发现,VV黑素细胞存在部分MITF表达下调与TYR、TYRP1和TYRP2的表达下调一致,提示VV黑素生成抑制于MITF的转录调控密切相关;而SV黑素细胞尽管存在显著的MITF表达下调,但TYR和TYRP1均正常表达,提示SV的黑素生成存在不依赖于MITF的转录调控。另外,VV存在TYRP2显著表达下降现象,而我们在另外的研究中还发现了MITF对TYRP2的负调控现象(待发表),提示TYRP2的功能可能并不局限于黑素生成的速度调节器。
很多皮肤疾病可根据皮损分布特点分为节段型与非节段型(寻常型),两者可能存在不同的发病机制。本研究结果表明,VV和SV存在不同的黑素细胞超微结构病理改变及MITF转录调控,我们还需要进一步证实VV和SV可能存在的不同发病机制.
参考文献:王平,洪为松,章莉,洪健,郑俊惠,徐爱娥,白癜风表皮黑素细胞超微结构及小眼畸形相关转录因子转录调控研究[J]中华皮肤科杂志2010年7月第43卷第7期