热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs),又称应激蛋白,是一类在进化上高度保守.广泛存在于自然界原核、真核细胞中的蛋白质,其在正常细胞中呈基础表达,执行一系列基本的生理功能,参与细胞的损伤修复,发挥应激保护作用.
银屑病属心身疾病范畴[1,2] ,它与机体内外环境急、慢性应激刺激密切相关.为了解银屑病患者在疾病演变过程中HSPs的变化及相互关系,我们应用LSAB免疫组织化学方法和真彩色医学图像分析系统,就HSP27,HSP70在银屑病患者治疗前后表皮细胞中的表达情况做了研究.
目的:研究银屑病患者治疗前后皮损表皮细胞中HSPs的表达情况.
方法:应用LSAB免疫组织化学法和真彩色医学图像分析系统,测定25例银屑病患者皮损、非皮损以及不同治疗方法治愈后表皮细胞中和6例正常人对照组表皮细胞中HSP27和HSP70的表达及含量.
结果:HSP27和HSP70在正常人表皮细胞中呈基础表达(HSP270.100±0.015A;HSP700.094±0.018A),在银屑病患者皮损中表达很弱或无表达(HSP270.068±0.028A;HSP700.034±0.014A),两者有显着性差异(P<0.05);在治愈后表皮中其表达量逐渐恢复(HSP270.105±0.028A;HSP700.078±0.022A);而不同治疗方法治愈后其表皮细胞表达含量间无明显差异.
结论:在银屑病患者皮损中,HSP27和HSP70表达消失,随着皮损治愈,HSP27和HSP70表达逐渐恢复,提示HSP27和HSP70可能在银屑病应激保护机制中发挥着重要作用.
1 材料和方法
1.1 材料
银屑病患者25(男12,女13)例;年龄14~69(平均35)岁,均为空军医院皮肤科门诊及住院患者,临床和病理确诊为寻常型银屑病;病程1wk~30a,其中静止期9例,进行期16例.患者自愿合作后取材.取材前1mo内未服用过皮质类固醇、免疫抑制剂及维A酸类药物,不伴
肿瘤及其他严重疾患.每例均用3mm环钻取患者背部皮损及相距5cm之非皮损各1块,1mo后再取治愈后皮肤1块.其中制银灵+外用药治疗为11例,
迪银片+外用药治疗为5例;另有3例住院患者在其他治疗方法相同的情况下于背部不同局部行静电治疗或外用去炎松治疗,治愈后各取皮1块.正常人对照6例取自外科非
皮肤病手术的正常皮肤.组织均以40g L-1 甲醛固定24~48h,经脱水、透明、浸蜡后,石蜡包埋,室温下保存.HSP27mAb为美国Neomarker公司产品,购自北京岳泰科技有限公司,HSP70mAb为美国Santa Cruz生物技术公司产品,它和LSAB免疫组化试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司;真彩色医学图像分析系统软件为北京航空航天大学图像分析中心与空军总医院联合研制.
1.2 方法
切取5μm厚石蜡切片,常规脱蜡至水;1g L-1 胰酶37℃消化30min;三蒸水洗3min×3;30mL L-1 过氧化氢孵育灭活内源性过氧化物酶,室温5min;三蒸水洗,2min×3;pH7.4的PBS缓冲液平衡5min;正常山羊血清封闭,室温下30min;倾去血清,加入适当稀释一抗(HSP27为1 50PBS稀释,HSP70为1 100PBS稀释),4℃过夜;PBS洗5min×3;滴加生物素标记二抗,1 300稀释,37℃孵育30min;PBS洗,5min×3;滴加辣根酶标记的链霉卵白素,1 300稀释,37℃孵育30min;PBS洗,5min×3;DAB显色;自来水充分冲洗,苏木素复染、脱水、透明、中性树脂封片.每次实验均以PBS代替一抗做阴性对照,以已知
结肠癌组织细胞核表达结果为阳性对照.图象定量分析采用多功能真彩色病理图像分析系统,对表皮角朊细胞中热休克蛋白的表达进行定量检测,用单位面积平均吸光度表示热休克蛋白的相对含量.
统计学处理:计量资料以均数±标准差(x ±s)表示,对银屑病皮损、非皮损、治愈后皮肤及正常人皮肤角质形成细胞HSPs抗原表达强度图像分析所得到的定量结果分别进行t检验和方差分析.
2 结果
正常人组和银屑病非皮损组、治愈后组表皮中HSP27及HSP70的表达量均明显高于银屑病皮损组(P<0.05).而正常人组、银屑病非皮损组及治愈后组表皮中HSP27的表达量间无明显差异,HSP70表 达量在正常人组和银屑病非皮损组间无明显差异,但在治愈后组表皮中的含量仍低于正常人组(P<0.05,Tab1).正常人组与制银灵治愈后组、迪银片治愈后组相比,表皮HSP27和HSP70的表达量无显着性差异(Tab2).HSP27和HSP70在正常人组、银屑病非皮损组、激素外用治愈后组及静电治愈后组表皮细胞中的表达量均明显高于银屑病皮损组.而在正常人组、银屑病非皮损组、激素外用治愈后组和静电治愈后组表皮细胞中,HSP27表达量之间均无显着性差异,HSP70除在静电治愈后组表皮细胞中含量低于正常人组有显着性差异外(P<0.05),余均无显着性差异(Tab3).表1 银屑病皮损、非皮损和治愈后表皮中HSP27,HSP70的表达(略)表2 不同po治疗方法治愈后表皮中HSP27,HSP70的含量(略)表3 银屑病皮损、非皮损和不同外用方法治愈后表皮中HSP27,HSP70表达(略)
3 讨论
以往的研究表明:在正常生理条件下,细胞中HSPs即呈基础表达,它们可作为“分子伴侣”(molec-ular chuperons)发挥重要的细胞管家作用,一方面参与基本的蛋白质折叠、伸展及胞内转运[3] ;另一方面可与细胞内许多功能蛋白,如甾体激素受体、酪氨酸激酶、肌动蛋白及微管蛋白等结合,使其稳定在一种失活或未装配状态,达到特殊部位或受到特定刺激后,再被激活而发挥作用
[4,5] .另外它们还参与免疫炎症反应,在抗原的加工呈递、淋巴细胞的归巢以及
免疫球蛋白的装配中发挥作用,它们可与免疫活性因子相互作用、相互制约,使细胞的内外环境相对稳定[6] .当正常细胞受到应激伤害时,细胞中某些蛋白质肽链伸展,失去折叠状态,而丧失正常功能,甚至发生不可逆变性,此时细胞内大量合成的HSPs可使肽链重新折叠恢复其结构和功能,并可参与降解那些不可逆变性的蛋白,以清除对细胞有害的变性产物[7] .细胞热休克应激后HSP27和HSP70的高表达可导致细胞中损伤的蛋白和核仁结构迅速修复,两者在细胞的应激保护效应中起到了重要的作用
[8-10] .HSP27主要出现于细胞增生高峰期和生长静止期的开始阶段,是细胞增生停止开始分化的标志,可作为角质形成细胞分化程度的标志[11-13] ;而HSP70可在细胞分裂增生过程中的DNA合成期起作用[14,15] .
我们的测定结果表明:HSP27和HSP70在正常人及银屑病非皮损表皮角质形成细胞中有明显胞质棕色颗粒状阳性表达,其表达量在这两组中无显着性差异,说明在正常人及银屑病非皮损中,HSP27和HSP70对维持表皮角质形成细胞的正常组织形态有重要作用;在银屑病皮损表皮中,表皮抗应激能力低下,HSP27和HSP70表达减弱,甚至失表达,从而在银屑病应激状态下失去其应激保护作用,出现银屑病损害,这与庞晓文等[16-18] 的研究结果一致.
我们进一步研究了采用不同方法治疗银屑病,皮损治愈后表皮中HSP27和HSP70的表达情况,发现随着银屑病皮损的消退,表皮中HSP27和HSP70也恢复表达,HSP27在愈后表皮中的表达量与正常人及银屑病非皮损无差异,三者均显着高于银屑病皮损;HSP70在治愈后表皮中的表达量仍低于正常人,但高于银屑病皮损,有显着性差异.由此可见,虽然银屑病患者已临床治愈,但其治愈后的HSP70表达量仍低于正常;说明临床治愈后还需一段时间才会真正恢复正常状态或有复发的可能.愈后表皮HSPs表达量的恢复与不同的全身治疗方法关系不明显,但不同的局部治疗方法对HSPs的恢复有影响,因例数较少,尚待继续探讨.
综上所述,HSP27和HSP70在银屑病应激保护机制中可能发挥着重要作用,深入研究银屑病皮损表皮角质形成细胞中HSPs表达抑制的原因以及HSP27和HSP70在其中所起的不同作用,为理解银屑病的发病机制及寻找理想的治疗方法开辟了新的思路.
参考来源:《第四军医大学学报》2001年10月22卷20期;《银屑病表皮细胞中热休克蛋白的表达意义》;李铀 ,杨守京,杨雪琴 ,庞晓文,孟如松