银屑病的发病机制极其复杂,其组织病理学的改变主要表现为角质形成细胞过度增殖、炎症细胞聚集和真皮乳头部血管扩张三大特征.其中,角质形成细胞过度增殖常常伴有异常的角化过程,同时出现角蛋白表达的改变.为了能够更好地研究银屑病的发病机制,合适而科学的动物模型显得极为重要.我们从分子水平研究心得安外涂所致豚鼠银屑病样动物模型的可行性.
目的:研究心得安外涂所致豚鼠银屑病样动物模型皮损中角蛋白K14,16,17表达水平的变化,从分子水平研究此种动物模型的可行性.
方法:用50g L-1 心得安乳剂外涂豚鼠耳背部皮肤诱导银屑病样动物模型,应用原位杂交法检测银屑病样皮损中角蛋白K14,16,17的表达.
结果:心得安外涂所致豚鼠银屑病样动物模型皮损中角蛋白K14,16表达水平较正常对照组明显增高,K17的水平无明显变化.
结论:心得安外涂所致豚鼠银屑病样动物模型不仅在组织病理学而且在分子水平上与人类银屑病皮损基本一致.
1 材料和方法
1.1 材料
30只健康成年豚鼠(体质量300~400g,雌雄不拘)由本校实验动物中心提供.50g L-1 心得安乳剂由西京医院药剂科配制.自行设计角蛋白K14,16,17探针,由北京奥科公司合成,原位杂交试剂盒购自博士德公司.
1.2 方法
①模型制备:实验动物随机分为两组,实验组20只,应用50g L-1 心得安乳剂均匀外涂双耳背皮肤,每日3次,连续涂4wk.对照组10只用单纯乳剂涂抹.4wk后取双耳背部皮肤,一只耳用100mL L-1 甲醛溶液固定,另一只耳置于干燥瓶中,存放于-80℃低温冰箱保存.②HE染色:将用100mL L-1 甲醛溶液固定的标本脱水,透明浸蜡后包埋,制作石蜡切片,常规HE染色.在光镜下逐一观察组织学所见.③原位杂交:置于干燥瓶中的组织经常规脱水、浸蜡包埋后切片,厚度6μm,展开在经多聚赖氨酸处理的载玻片上,切片经常规脱蜡脱水,30mL L-1 H 2 O2 室温处理10min以灭活内源性过氧化物酶,PBS洗5min×3次.滴加胃蛋白酶工作液,37℃消化10min,充分暴露mRNA,0.5mol L-1 PBS洗5min×3次,蒸馏水洗1次.每张切片上加20μL含标记探针的原位杂交液,盖上专用盖玻片,置湿盒中37℃杂交过夜.同时设不加探针的空白对照.分别用30℃的2×SSC和0.2×SSC各洗涤5min×3次.滴加封闭液,室温20min.滴加兔抗地高辛,37℃孵育1h,0.5mol L-1 PBS洗2min×3次.滴加生物素化羊抗兔IgG,37℃孵育30min,0.5mol L-1 PBS洗2min×3次.滴加SABC,7℃孵育30min,0.5mol L-1 PBS洗5min×4次.DAB显色,苏木素复染,充分水洗,然后乙醇脱水,二甲苯透明,封片.
2 结果
2.1 HE染色结果
正常对照组豚鼠皮肤可见菲薄的角质层,颗粒层约为1~3层,棘细胞层约3~5层,基底层为单层柱状细胞.真表皮交界较平,真皮内有散在少数单核细胞浸润(Fig1).实验组全部标本共40份均可见到不同程度的棘层肥厚、表皮突延伸呈棒状、真皮乳头上伸杵状变及毛细血管扩张,36份标本可见广泛或局灶性的角化不全,颗粒层变薄或消失(Fig2).我们参考通用的Baker评分方法,对每份标本逐一进行组织学评分分析.应用组织评分法(典型的银屑病皮损评分在4.0~10.0之间)评分得到,40份涂药组标本组织学评分为7.6±0.6,20份正常对照组组织学评分为0.8±0.1,经统计学处理结果差异显着(P<0.01).
2.2 原位杂交结果
对正常豚鼠耳背部皮肤和银屑病动物模型皮损处组织的K14,16,17原位杂交结果显示,正常皮肤中,在基底层细胞中见到K14的阳性杂交信号,表现为细胞浆中出现棕黄色细小或粗大颗粒,但信号较弱,而K16和K17则未见到阳性信号.在银屑病样皮损中,基底层及棘细胞层均有K14的高表达,在棘细胞层K16高表达;而K17仅为低表达(Fig3~6).根据图象扫描后的处理结果显示,银屑病模型动物皮损处角蛋白K14及K16的表达较对照组显着升高(K14P<0.05,K16P<0.01),而K17的表达则无显着性差异.
图1 正常对照组HE染色(略)
Fig1 HE staining of normal control group ×200
图2 实验组HE染色(略)
Fig2 HE staining of treated group ×200
图3 正常对照组角蛋白K14原位杂交(略)
Fig3 Keratin14hybridization in situ of normal control group ×200
图4 实验组角蛋白K14原位杂交(略)
Fig4 Keratin14hybridization in situ of treated group ×200
图5 正常对照组角蛋白K16原位杂交(略)
Fig5 Keratin16hybridization in situ of normal control group ×200
图6 实验组角蛋白K16原位杂交(略)
Fig6 Keratin16hybridization in situ of treated group ×200
3 讨论
银屑病是一种具有多基因遗传特性的疾病,其发病机制极其复杂,至今尚未完全明了.其中研究报道它与感染、内分泌机能障碍、免疫功能紊乱、酶的改变及遗传因素有关.银屑病的组织病理学主要表现为角质形成细胞过度增生、炎症细胞聚集和真皮乳头部血管增生扩张三大特征,从而出现角化过度、角化不全、颗粒层消失、棘细胞层增厚、表皮突延伸呈棒状、真皮乳头上伸呈杵状改变.为了能够更好的研究其发病机制,曾经有学者设计了多种动物模型,其中心得安外涂所致豚鼠耳背部皮肤银屑病样皮损的方法由于简便易行,目前已广泛地应用于制备银屑病动物模型.
本实验中我们以50g L-1 的心得安乳剂外涂于豚鼠耳背部皮肤,不但重复了Gaylarde等[1,2] 以心得安涂药在豚鼠侧背部皮肤造成的角化过度,角化不全和棘层肥厚诸改变;还见到了广泛或灶状的颗粒层消失及表皮突延长呈棒状和真皮乳头上伸呈杵状改变,这些特点更加接近人类银屑病的组织病理学改变.由此可见,心得安外涂在豚鼠皮肤引起银屑病样皮损从组织病理学上观察具有可行性和较高的可重复性.
在银屑病的组织病理学改变中,角质形成细胞的过度增殖是主要的特征.过度增殖的角质形成细胞同时出现了异常的角蛋白表达.早在1960年Roth-berg就发现银屑病患者与正常人相比表皮角蛋白就有差异,目前较为一致的看法主要是集中在K5/K14,K1/K10,K6/K16和K17的变化.在正常表皮内,K5/K14的转录主要在基底层,而基底上层基本没有,其蛋白的表达主要位于基底层并随后呈现明显的下降趋势[3] .Holland等[4] 和Thewes等[5] 发现银屑病皮损内K5和K14的水平同正常表皮相比发生了变化,K5明显降低而K14却显着增高.K1和K10在正常表皮只是在基底上层大量表达,被认为是表皮正常表达的标志[6] .银屑病皮损处K1和K10的表达较正常表皮明显减少,取而代之的是角蛋白K6和K16的表达.K16是过度增生的表皮的特征,同时它在银屑病活动性皮损边缘处也有表达,被认为是基底层以上细胞的一种早期变化[7-9] .Thewes等进一步证实临床上银屑病患者尚未受累的皮肤也有K6和K16的表达,该发现可以很好的解释Kobner现象,认为K16可以作为检测银屑病的有效标志;K17在正常人表皮不表达,而在银屑病患者的皮损处出现高表达,被认为是银屑病相关性角蛋白[10,11] .同时,最近的研究发现天然抗角蛋白自身抗体(AK auto Abs)在银屑病发病及治疗过程中起着重要的作用[12,13] .
我们的实验结果显示:应用原位杂交的方法检测心得安所致的豚鼠银屑病样皮损中角蛋白K14,K16mRNA的表达水平,结果实验组较正常对照组均明显增高(P<0.05,P<0.01),得到了与人类银屑病皮损一致的结果,从而在分子水平上进一步证明了心得安外涂所致银屑病样皮损的豚鼠动物模型的可行性.但角蛋白K17则和正常对照组无明显的差异,这说明了此种动物模型只是在一些方面较好的模拟了人类银屑病的发病机制,但由于人类银屑病发病机制的复杂性,在没有准确地找到其致病基因的前提下,所有的动物模型都会有其局限性.
参考来源:《第四军医大学学报》2001年12月22卷24期;《豚鼠银屑病样动物模型中角蛋白K14,16,17表达水平的变化》;樊平申,廖文俊,刘玉峰