【摘要】目的 探讨南京地区肛门及肛管尖锐湿疣病变中人乳头瘤病毒(HPV)不同基因型别的感染情况及其临床意义。方法 从196例肛门及肛管尖锐湿疣(CA)石蜡组织标本中提取23种HPV DNA,采用基因扩增芯片杂交技术对其进行HPV基因型别的检测,并对患者进行临床病理资料分析。结果 196例肛门及肛管CA病变组织标本中检出HPV总阳性率为67.86%(133/196),其中单一型别的阳性率为55.61%(109/196);单一型别的感染中HPV6型阳性率为28.06%(55/196),是最主要的感染型别,其次为HPV 11型,阳性率为27.04%(53/196);混合型HPV感染阳性率为12.25%(24/196),其中HPV6型与11型混合感染占50.00%(12/24),是混合型感染的主要型别,此外还有5例4种型别的混合感染,占混合感染的20.83%(5/24)。结论 基因扩增芯片检测技术是一种比较适合临床进行HPV分型检测的、敏感性高、特异性好的诊断方法,尤其适合开展某种病变中HPV感染的分子流行病学的研究。
【关键词】尖锐湿疣;人乳头瘤病毒;肛门;肛管;基因分型
中国与世界各地交往日益广泛,人员往来愈加频繁,为性传播性疾病传人中国提供了可乘之机。其中,尖锐湿疣(CA)已跻身为中国三大性病之一。世界卫生组织新近提出人乳头瘤病毒(HPV)感染性疾病的诊断不仅要有临床和病理学诊断,还应具有基因水平的诊断才能确诊。随着分子生物学技术的快速发展,基因诊断技术在病毒感染性疾病的诊断、研究和临床应用已Et趋成熟,此类技术的临床应用可以解决HPV感染的定性、定位、分型及定量诊断问题,也可以解决其他病毒感染与HPV感染性疾病的鉴别诊断问题,这将为临床进一步治疗提供客观、准确、科学的依据。本研究应用基因扩增分型技术对196例肛门及肛管CA组织进行了HPV型别的基因检测,为肛门及肛管CA的预防、治疗、HPV诊断试剂和疫苗的研发以及分子流行病学调查提供理论依据,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料 收集1985年1月至2011年4月南京中医药大学第三附属医院经全国肛肠医疗中心手术切除的196例南京地区肛门及肛管CA病变的常规石蜡组织标本,其中男108例,女88例,男女之比为1.23:1;年龄12~71岁,平均年龄38.33岁,20~ 60岁患者180例,占患者总数的91.84%(180/196)。肛管CA18例,肛门CA178例。由2位经验丰富的病理医师结合临床,依据肛门及肛管CA大体及显微镜下的组织形态学特征,作出符合肛门及肛管CA的诊断,同时复习其临床病理资料。
1.2 仪器与试剂 HPV基因分型检测试剂盒(由深圳亚能生物技术有限公司提供);基因扩增仪为新加坡生产的Gene Amp PCR System 2400型;分子杂交仪为江苏省兴化市分析仪器厂生产的FYY-3型;高速冷冻离心机为德国生产的Eppendorf 5810R型;生物安全柜为江苏省苏州市安泰空气技术有限公司生产的BHC-1300 II A2型。显色液须新鲜配制,使用时按所需浓度加蒸馏水配制。
1.3 方法
1.4 统计学处理 采用SPSS12.0统计软件进行χ2检验。
2 结果
196例肛门及肛管CA患者中,133例检出感染HPV,总阳性率为67.86%(133/196)。单一型别的HPV感染109例,占55.61%(109/196),单一型别的感染中,HPV6型感染55例,阳性率为28.06%(55/196),是最主要的感染型别,其次为HPV11型,其阳性率为27.04% (53/196)。混合型HPV感染24例,占12.25%(24/196),其中HPV6型与11型混合感染12例,占混合型感染的50.0% (12/24),是混合型感染的主要型别,其次是5例4种型别的混合感染,占混合型感染的20.83%(5/24),分别为HPV 6型、11型、16型、18型混合感染1例,HPV 6型、11型、33型、52型混合感染1例,HPV 6型、11型、16型、33型混合感染2例,HPV 6型、11型、16型、66型混合感染1例。另外8例HPV感染分别是HPV 6型、18型混合感染1例,HPV 6型、52型、73型混合感染1例,HPV 11型、33型混合感染1例,HPV 11型、58型混合感染2例,HPV 11型、59型混合感染1例,HPV 11型、66型混合感染1例,HPV 58型感染1例。
3 讨论
HPV属乳头瘤病毒科,是一类特异感染人类上皮、黏膜的微小共价双链环状DNA病毒,其以闭合超螺旋结构、开放的环状结构、线性分子结构3种形式存在。现已发现乳头瘤病毒及HPV有200多个型别、亚型及变异体,至今已鉴定出一百多种。人类是HPV的唯一宿主。世界卫生组织(WHO)、国际癌症研究学会(IARC)根据HPV致癌危险性的高低将其分为低危型和高危型两大类。分子流行病学调查显示,高危型HPV导致宫颈癌的概率约为100%,而低危型HPV导致宫颈癌的概率仅为0.10%。目前发现有30多种高危型及10多种低危型HPV致癌致瘤,其中18种高危型和4种低危型比较常见。本研究选择了23种最常见致癌致瘤的HPV型别作为研究的感染源,此23种HPV 型别大约占致癌致瘤型别的95%左右。由于目前人们都把目光主要集中在女性生殖道疾病的HPV研究上,而直肠、肛管及肛门区HPV感染的专题研究尚无人触及,全世界尚无确切可靠的直肠、肛管及肛门区23种HPV感染的流行病学的研究资料。当前HPV基因检测是捕获HPV感染最好的方法。临床上对HPV感染的诊断都是通过检测病毒DNA,现常用的HC-Ⅱ、荧光定量PCR法和原位杂交法均不能对HPV进行高通量的分型检测,不适合用于HPV感染相关疾病的流行病学和病因学的深入研究。本文采用的高通量的分型检测技术对196例肛门及肛管CA的石蜡组织标本进行了23种HPV基因分型的回顾性研究,并对其基因型别所占的比率作了比较和分析。
CA是一种性传播疾病,主要通过性接触传播,男女均可发病。引起本病的主要类型为HPV 的6、11、16、18、31、33、35型。85%是由性传播而感染的。CA是欧美国家最常见的性病之一,其发病率逐年上升。CA在中国也是最主要的性传播疾病之一,在中国南方比北方多见,以20~34岁者发病率最高。男性常发生于冠状沟、包皮、龟头、系带及尿道口,有时可见于阴茎体及周围皮肤,但很少长于阴囊,男性同性恋者可发生于肛门及直肠。女性多见于大小阴唇、阴蒂、阴道、子宫颈及肛周。偶尔可出现在口腔、腋窝、脐窝、趾间和乳房下部、腹股沟。至少有20%的女性CA患者可波及肛周。本研究从133例肛门及肛管CA石蜡组织切片中检出10种HPV型别,分别是6、11、16、18、33、52、58、59、66、73型,未发现31和35型。发病年龄在20~40岁的患者105例,占总人数的53.57(105/196)。196例肛门及肛管CA患者中,男性发病可能多数与同性恋行为有关,女性多数是外阴CA波及肛门及肛管处。
随着HPV基因检测手段的改进,一些亚临床阶段的HPV感染已经被发现,这些亚临床HPV感染可以单独存在,也可与CA并存,主要表现为:(1)微小的无蒂疣,可单发或多发;(2)微小的乳头状隆起,多发,呈绒毛状隆起,有时众多小突起融合形成颗粒状外观;(3)外观正常的斑状病损,肉眼观察似为正常,但用醋酸涂布后出现白色,用放大镜才可见有斑状改变。近年来文献上逐渐将尖锐(acuminatum)一词略去,统称生殖器湿疣(condyloma),生殖器湿疣包含了从起初微小病损到巨大CA的所有病变,从病理组织学上可分为:微小湿疣;典型CA;巨大CA三种形态。本文报道的196例CA组织形态学属比较典型的CA。
从本研究结果来看,196例肛门及肛管CA患者中HPV感染率达67.86%,表明肛门及肛管是又一个HPV易感染部位。所有133例HPV阳性的肛门及肛管CA患者除l例外都伴有6型或11型HPV感染,混合型感染除了12例HPV 6型、11型混合感染外,其余12例HPV混合感染及1例单一型感染都伴有高危型别的HPV感染,而高危型别的HPV往往是CA癌变的重要诱发因素,也是诱发肛门及肛管上皮癌变的重要诱因。因此,对所有伴有高危型别HPV 感染的CA患者进行HPV感染型别的追踪检测显得非常必要,如果他们成为持续性的感染者,就可成为HPV的重要传染源,而且发生肛门及肛管癌的风险将大大增加,应引起高度重视。本研究196例CA患者中,20岁以下者4例,70岁以上者2例(包括1例70岁的患者),60岁以上者12例,20~60岁者180例,占患者总数的91.84%(180/196);提示肛门及肛管CA主要发生于性活跃的群体;肛门及肛管CA往往容易复发,这与CA治疗后,其周围皮肤中仍然存在HPV有关。本研究196例肛门及肛管CA患者只有133例检出HPV阳性,有63例为HPV阴性,这说明63例HPV阴性的CA患者中存在着两种情况,一是HPV阴性的CA中可能存在着HPV 6、11、42、43、44型以外的型别,提示试剂厂家应开发出符合中国CA感染谱的低危型别的HPV 检测试剂,二是HPV阴性的CA在组织形态学上非常像CA,但实际上又不是HPV引起的病变,也就是说很可能是一种假性湿疣。本研究的196例肛门及肛管CA患者中没有检测到42、43、44型HPV,提示42、43、44型HPV不是引起南京地区肛门及肛管CA病变的型别。本研究采用的高通量HPV分型检测技术不但能对细胞,也能对组织标本进行检测,不但能对新鲜标本进行实时研究,而且还可对石蜡组织进行回顾性研究,是HPV 分型检测的一种快捷、实用、高通量的检测方法,值得推广。
总之,对直肠、肛门及肛管的HPV感染的研究才刚刚开始,还有许多的问题需要研究者去探索和发现。由于HPV是人类良、恶性肿瘤的重要诱因,值得研究者对其进行多中心大样本量的基因研究,为肛门直肠恶性肿瘤的防治提供科学的依据。
(唐永发,耿建祥,196例肛门及肛管尖锐湿疣病变中HPV感染的研究[J]国际检验医学杂志2012年6月第33卷第l1期:1303、1304、1307)