类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性对称性多关节炎为主要临床表现的自身免疫病。其发病机制还不清楚。研究发现,具有自身反应性的T细胞,如Th1细胞进而Th17细胞发挥了重要的作用,他们聚集到异常增生的滑膜组组,导致长期的关节炎症和组织破坏。相比之下,具有可以抑制自身反应性淋巴细胞过度增值功能的调节性T细胞在RA患者中存在缺陷,进一步导致了机体免疫平衡的失调。近年来,生物制剂肿瘤坏死因子(TNF)- 拮抗剂成为治疗RA疗效确切的药物之一,但其缓解病情的内在机制尚未完全明确。本研究旨在通过探讨重组抗(TNF)- 人鼠签合单克隆抗体(anti-TNF rcMAb)对RA患者外周血Th1、Th17、调节性T细胞比例以及他们相关的转录因子T-bet、维甲酸相关孤核受体(ROR)C、叉头状转录因子3(Foxp3)的影响,以期发现TNF- 拮抗剂治疗方案的作用机制。
1 对象与方法
1.1 研究对象
所有参与研究的患者均使用由中信国健药业有限公司研制anti-TNF rcMAb。而次研究是由中信国健药业有限公司2008年发起的以单用甲氨蝶呤为对照,平价注射用anti-TNF rcMAb联合甲氨蝶呤RA的有效性和安全性的随机、双盲、多中心临床试验的一部分。本中心患者,共50例,男性7例,女性43例,年龄19~63岁,平均(46±12)岁。
1.2 入选标准
所有病例均符合美国风湿病学会1987年制定的RA分类标准,且筛选时病情处于活动期;使用甲氨蝶呤治疗至少3个月,且剂量稳定在7.5~15mg/周,至少已4周;如正使用非甾体抗炎药(NSAIDs),则剂量至少稳定一周;若筛选时未使用NSAIDs,则至少1周未用;若正口服糖皮质激素,则剂量必须稳定在≤10mg/d(相当于波尼松剂量)至少4周;曾使用过1种或1种以上改善病情抗风湿药(DMARDs)治疗失败,但筛选前4周内已经停用甲氨蝶呤以外的DMARDs(包括但不限于:氯喹、羟氯喹、金制剂、青霉胺、柳氮黄吡啶、硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢素A、来氟米特、金诺分、雷公藤多苷等)。年龄18~65岁男女不限。
1.3 排除标准
过敏体质或已知对人免疫球蛋白过敏或对anti-TNF rcMAb成分过敏;关节功能状态处于Ⅳ级或关节X征象处于Ⅳ级;筛选前4周内接种过活(减毒)病毒/细菌疫苗,或使用过治疗RA的中草药;筛选时正在参加其他临床试验;筛选前3个月内使用过任何生物制剂(如:依那西普、英夫利西单抗、阿达木单抗、利妥昔单抗等);现患或曾有过活动性结核病史;筛选前6个月内曾有过严重的感染或正处于急性感染或慢性感染反复发作期;筛选前6个月内曾有过机会性感染;有人工关节感染史,或有可疑人工关节感染已经接受过抗生素治疗且该人工关节未切除;筛选前3个月内进行过器官移植手术;现患者曾有过全身性自身免疫病,其症状和体征预期会影响对试验药物的评价。
按照程序在研究开始前,由上海市光华中西医结合医院医学理论委员会讨论认为本研究符合人体试验所制定的伦理学标准并得到院理论委员会批准。所有受试对象在筛选前均签署知情同意书。
1.4 分组情况
所有患者均为风湿科门诊患者,且均符合美国风湿病学会(ACR)1987年修订的RA分类标准。由统计学专家使用SAS8.0软件包随机数字生成器生成随机数字表并制定随机卡片,按照随机卡片由计算机产生序号、随机数及分组数,制成随机卡装信封备用。合格受试者按进入临床的先后顺序,拆开号码相同的信封,按信封内卡片规定的分组进行治疗。由此随机分为2组:①联合治疗组(甲氨蝶呤+anti-TNF rcMAb):40例,其中男性3例,女性37例,年龄23~63岁,平均(46±11)岁;②对照组(甲氨蝶呤+安慰剂)10例,其中男性4例,女性6例,年龄19~59岁,平均(47±12)岁。
1.5 给药方法
符合入组标准且不符合排除标准的RA患者由计算机程序按随机分配原则分为2组。联合治疗患者接受anti-TNF rcMAb(3mg/kg)+甲氨蝶呤治疗;对照组患者接受甲氨蝶呤单独治疗,分别于0、2、6、14周给药。
1.6 外周血Th1、Th17、调节性T细胞的检测
1.6.1 人外周血单个核细胞(PBMCs)的制备:肝素抗凝静脉血与等体积RPMI 1640培养液充分混匀,用巴氏滴管将稀释的血液轻轻加于淋巴细胞分离液Ficoll(勿扰乱液面),离心2000r/min,20min。离心后管内分为3层:上层为血浆和RPMI 1640培养液,下层主要为红细胞和粒细胞,中层为淋巴细胞分离液,单个核细胞层分为白色絮状,位于上、中层页面交界处。小心吸出单个细胞层,至另一离心管中,加RPMI 1640培养液洗涤,离心1500r/min,10min,去上清,重复1次,重悬细胞,计数,待用。
1.6.2流式细胞染色:对于胞内染色,PBMCs首选必须用聚丙烯酸甲酯(PMA)(50ng/ml)、罗红霉素(500ng/ml)和高尔基体抑制剂(ColgiPlug)刺激5h。表面染色时,加入荧光标记的表面抗体人CD4-多甲澡叶绿素蛋白(Percp)-Cy5.5(BD Pharmingen),4℃,避光孵育30min。洗涤后,用破膜固定液固定,4℃,避光孵育20min,胞内染色时,用抗人白细胞介素(IL)-17-澡红蛋白(eBioscience)和抗人IFN- -别澡青蛋白(APC,BD Pharmingen)染Th17和Th1细胞。
进行调节性T细胞染色检测时,表面染色用抗人CD4- Percp-Cy5.5(BD Pharmingen)和抗人CD25-澡红蛋白(Miltenyi Biotec)染CD4和CD25分子,用Cytofix/Cytoperm缓冲液试剂盒(eBioscience)4℃、避光孵育30min,进行破膜固定,然后用抗人Foxp3-异硫氰酸荧光素(FITC)(eBioscience)4℃、避光孵育60min进行Foxp3染色。
所有染色样本均由FACS Calibur流式细胞进行检测,流式数据均用FlowJo软件进行分析。
1.6.3 实时定量聚合酶链反应(PCR)检测:RNA抽提:使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)抽提RNA,具体步骤:取(1~5)× 的细胞,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次;加入含1% 2-ME的RIT裂解液350µl,反复吹打裂解;加入等体积70%乙醇混匀;吸出样品上柱,室温离心(12000r/min,15s);弃收集管中液体,加RW1洗液350µl,室温离心(12000r/min,15s);弃收集管中液体,用RNeasy-free DNase试剂盒(Qiagen),加DNaseI(10µl+70µl缓冲液)76~80µl,室温作用15min,去除DNA;加RW1洗液359µl,室温离心(12000r/min,15s);更换新的收集管,加RPE洗液(含乙醇)500µl,室温离心(12000r/min,15s);弃收集管中液体,室温离心(12000r/min,2min);弃收集管中液体,换RNeasy-free的1.5倍离心管作为收集管,加RNeasy free水30µl,离心(12000r/min,1min),收集RNA;吸光度 定量,计算RNA浓度,-80℃保存备用。
cDNA合成:使用Sensiscript反转录试剂盒(Qiagen)进行逆转录,合成cDNA,反应体系为总体积:20µl/管(10×buffer 2µl,Dntp Mix(5mmol/L)2µl,随机引物(50ng/µl)1µl,Sensiscriptnt逆转录酶1µl,RNA酶抑制剂(10U/µl)1µl,RNA<50ng,无RNA酶水补充至20µl。反应条件:37℃1h;93℃5min;4℃维持。完成逆转后,-20保存备用。
引物设计:应用PrimerEspress软件(Applied Biosystems)进行引物设计,并用基本区域比对搜索工具(BLAST)进行比对确认。所引用的引物序列如下:甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH):上游引物5′-GT-GAAGGTCGGAGTCAACG-3′,下游引物 5′-TGAGGTCAATGAAGGGGTC-3′;RORC:上游引物5′-CGGGCCTACAATGCTGACA-3′,下游引物5′-GCC-ACCGT-ATTTGCCTTCAA-3′;T-bet:上游引物5′-GCCTACCAGAATG-CCGAGATTA-3′,下游引物5′-TCAAAGTTCTCCCGGAATCCT-3′;Foxp3:上游引物5′-CGGACCATCTTCTGGATG-AG-3′,下游引物5′-TTGTCGGATG-ATGCCACAG-3′。
实时定量PCR检测:将反转录产物cDNA,加双蒸水4倍稀释,用荧光染料SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)5µl,与目的基因引物或内参引物0.15µl混匀,短暂离心。反应体系:总体积:10µl/孔(2×SYBR Green Master Mix 5µl,引物(5µmol/L)0.15µl,cDNA(去离子水5倍稀释)4.85µl),加样,三复孔,加密封膜。实时定量PCR仪检测,程序如下:50℃,2min;95℃,10min;95℃,15s;60℃,60s;后两步骤,作40个循环。根据PCR反应信号强度的Ct(threshold cycle)值,计算出样本基因的相对表达量。
1.7 疗效观察指标及评价指标
1.7.1 临床指标:晨僵持续时间;关节肿胀计数;关节触痛计数;疼痛程度;健康评估问卷(HAQ);患者对自我疾病总体状况的评估;医生对患者疾病总体状况的评估。
1.7.2 理化指标:红细胞沉降率(ESR);C反应蛋白(CRP);类风湿因子(RF);抗核抗体;Th1、Th17、调节性T细胞;双手(含腕关节X线)。
1.7.3 评价指标:采用美国风湿病学会所指定的标准ACR20、ACR50、ACR70来评价疗效。
1.8 统计学处理
采用SPSS11.0统计软件进行分析。计量资料用t检验,计数资料用 检验或Ridit分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 患者基本情况和基本特征:患者的人口学特征和疾病情况。所有入选患者病程均属于活动期中重度,70%以上患者RF呈阳性,平均病程4~6年。联合治疗组和对组组临床及实验室各项指标的基线差异无统计学意义,这些指标进一步说明患者具有中度或重度RA症状。2组治疗前一般情况及各疗效指标差异无统计学意义,具有较好的可比性。在14周的疗程中,联合治疗组的脱落率为7.5%,对照组的脱落率为10%。2组脱落的主要原因是过敏反应、肝功能损害、血小板低于等不良反应。
2.2 2组有效率比较:经过Ridit分析,2组的ACR疗效比较在治疗后2周差异有统计学意义(P<0.01)。
2.3 2组联合治疗前后对Th1、Th17和调节性T细胞的影响:Th17细胞在对照组中有所上升,在联合治疗组中无明显变化;在联合治疗组中,调节性T细胞比例明显升高,差异且有统计学意义。
2.4 2组联合治疗前后对Th细胞转录因子的影响:治疗前,联合治疗组和对照组差异无统计学意义,说明两组具有可比性;无论是在联合治疗组还是对照组,Th17细胞与Th1细胞的转录因子Foxp3的表达量均升高,但差异无统计学意义。
3 讨论
RA是一种以对称性多关节炎为主要临床表现的慢性、进行性、侵蚀性自身免疫病。其核心是滑膜和骨的侵蚀和破坏。RA的发病机制目前尚不十分清楚。最近认为,TNF- 和白细胞介素(IL)-1在其发病中起着关键的作用,并最终导致滑膜和关节软骨的损伤,阻断这些细胞因子的通路,可减轻炎症及关节破坏,有效缓解RA病情。
致病性炎症细胞Th17、Th1细胞及调节性T细胞亚群的失衡是引起RA发病及滑膜炎症、骨破坏的机制之一。Th17细胞于2005年被定义为新的Th细胞亚群,分泌促炎性细胞因子IL-17、IL-17F、IL-21、IL-22,亦可分泌TNF- 和IL-6等,在自身免疫病和抗染色免疫中扮演了重要角色。Sakaguchi等在胸腺中分离得到一群高表达CD25的CD4单阳性T细胞,将其称为调节性T细胞,在健康人和小鼠外周血和脾脏CD T细胞中占5%~10%。Foxp3是调节性T细胞特异性转录因子可抑制自身反应性淋巴细胞的过度增殖,在维持机体的免疫平衡、促进免疫耐受、预防和控制自身免疫疾病中起着重要的作用。RORC是促进Th17细胞分化、调节其功能的特异性转录因子。有关Th17和调节性T细胞亚群的研究揭示了RA发病机制的热点之一。
经过我们18周随机双盲对照研究发现,联合治疗比单用甲氨蝶呤治疗疗程症状改善更为明显,6周的ACR20有效率已经超过50%,ACR50、ACR70的有效率明显高于对照组,甲氨蝶呤+anti-TNF rcMAb联合用药起效快,作用强度优于单用甲氨蝶呤的对照组。
同时,通过对患者治疗前后的外周血辅助性T细胞亚群变化检测发现:联合治疗组Th1细胞比例在第18周时有所下降,调节性T细胞比例明显上升,Th17细胞比例几乎无变化;在对照组中,Th1和调节性T细胞也相应降低和升高,但Th17细胞较第0周略有上升。实时定量PCR检测各亚群细胞转录因子,Th17、Th1细胞的转录因子RPRC、T-bet表达在2组中均降低,调节性T细胞转录因子Foxp3表达均升高。
anti-TNF rcMAb与可溶性的TNF- 有很高的亲和力,能有效地减轻患者的症状和降低疾病的活动度,如关节肿胀、疼痛、晨僵的改善及ESR,C反应蛋白的下降。在其他自身免疫病,如强直性脊柱炎、克罗恩病、银屑病等的治疗中疗效也很好。研究发现,TNF可下调Foxp3的表达,从而抑制调节性T细胞的功能,本研究中证实,经过TNF- 抗体治疗后的患者,临床症状得到明显改善,患者外周血调节性T细胞的比例明显上升,Th1细胞的比例有所下降,其作用机制可能通过提高调节性T细胞的比例,进一步抑制Th1等炎症细胞。
综上所述,anti-TNF rcMAb联合甲氨蝶呤用药,可影响患者外周血Th17、Th1、调节性T细胞亚群的比例,对RA患者病情的改善起到一定的作用,这与陈俊伟等报道结果类似。通过本研究对RA免疫应答失衡机制有了更为深刻的了解。我们将进一步研究其对各群细胞功能的影响,以期进一步揭示anti-TNF rcMAb对控制RA病情的内在机制。